1、背景：肺癌已經(jīng)成為引起全球癌癥相關(guān)死亡的首要病因，其死亡率占惡性腫瘤死亡的第一位。根據(jù)國際癌癥研究中心的報告結(jié)果顯示，全球范圍內(nèi)，由于肺癌造成的死亡人數(shù)在不斷增加，截止到2013年，全球肺癌死亡人數(shù)約為160萬人，占惡性腫瘤死亡病例的19.4%。目前肺癌的治療采用外科手術(shù)為主的綜合療法，但約有80%的肺癌患者確診時已是晚期，經(jīng)過化療、放療等治療后，晚期肺癌患者的預(yù)后差強人意。而術(shù)后輔助化療的治療方法雖然已被證實能夠降低復(fù)發(fā)率，改善腫瘤患

2、者的生存率，但是增加了其它惡性腫瘤的發(fā)生率，例如卵巢癌、消化道腫瘤及胰腺癌等。近些年來，基因靶向治療漸漸走進人們的視野，但是，這種治療手段并不能有效減輕患者的痛苦還增加了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此相對天然且毒性小的藥物的研究開發(fā)成為癌癥治療的新課題。這類抗癌藥物副作用少，耐藥性低，成本較其它治療手段低，為癌癥治療提供了新方向。
　　槐耳清膏（Huaier aqueous extract）是一種真菌類的抗腫瘤藥物，它的主要活性成分是槐耳多

3、糖蛋白，是由6個單糖結(jié)合18種氨基酸組成的結(jié)合蛋白，是一種活性很高的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑?；倍甯嗑哂姓T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性，提高免疫細(xì)胞殺傷能力，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力等多靶位抗腫瘤功效?；倍甯喟l(fā)揮其抗腫瘤作用時對正常細(xì)胞幾乎沒有損害。已有多項研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏對肺癌的療效顯著，但具體機制目前尚未闡明。
　　在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程中

4、，細(xì)胞表面的連接復(fù)合物分解消失，導(dǎo)致細(xì)胞與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，使細(xì)胞獲得遷移和穿透間質(zhì)的能力。EMT過程參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是腫瘤局部浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。EMT過程受到多種信號通路的調(diào)控，其中Wnt/β-catenin通路是誘導(dǎo)上皮組織發(fā)生EMT的關(guān)鍵信號通路，其核心成分β-catenin主要參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和通路下游靶基因如基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等的調(diào)控。阻斷或逆轉(zhuǎn)EMT過程對于腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。Hippo-

5、YAP信號通路在維持細(xì)胞的增殖/凋亡平衡和組織器官發(fā)育中扮演著重要角色，其核心組分是 YAP。Hippo-YAP通路的異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，直接或間接作用于Hippo-YAP通路治療腫瘤似乎具有可行性。
　　人肺腺癌細(xì)胞系 A549是目前應(yīng)用最廣泛的人肺腺癌細(xì)胞系，1972年通過人肺癌組織移植培養(yǎng)建系，鏡下觀察呈梭形，具有肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的特性和表型。具有雙向轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細(xì)胞系M-LAC（Metastastic L

6、ung Adenoarcinoma）是本課題組以人肺腺癌患者的惡性腹水為瘤源建立的，其中50%淋巴道轉(zhuǎn)移，25%血道轉(zhuǎn)移。與A549相比，M-LAC少量表達(dá)間葉表型標(biāo)記分子Vimentin，體外侵襲力相對高，腫瘤抑制基因 Rb、p53、促增殖基因 c-myc和血管生成相關(guān)因子VEGF-A高于對照組A549細(xì)胞。因此，人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和M-LAC是研究人肺癌發(fā)生、演進、診斷及治療的一對較為理想的細(xì)胞模型。本課題以人肺腺癌A549及M

7、-LAC兩個細(xì)胞系為研究對象，研究槐耳清膏對A549及M-LAC兩組細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響并對可能的分子機制進行初步探討。
　　目的：
　　1．檢測槐耳清膏對人肺腺癌細(xì)胞系 A549和 M-LAC生長增殖能力、遷移能力、侵襲能力以及凋亡情況的影響；
　　2．檢測槐耳清膏對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及M-LAC細(xì)胞EMT過程的影響，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物 E型鈣黏蛋白（epithelium-cadherin）及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波

8、形蛋白（Vimentin）的表達(dá)；
　　3．檢測β-catenin的變化以探討槐耳清膏對人肺腺癌細(xì)胞系 A549及 M-LAC細(xì)胞Wnt信號通路的影響；檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）在人肺腺癌細(xì)胞系 A549及 M-LAC的表達(dá)，以探討槐耳清膏對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及M-LAC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的影響；
　　4．檢

9、測 Hippo-YAP信號通路核心組分 YAP、P-YAP及結(jié)合因子 Bax、bcl-2的表達(dá)，以探討Hippo-YAP信號通路在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及M-LAC細(xì)胞增殖凋亡中的作用。
　　方法：
　　1．培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞A549和M-LAC，CCK-8法檢測不同濃度（0、2、4、6、8、10mg/mL）槐耳清膏作用24h、48h、72h后對A549及M-LAC細(xì)胞生長和增殖的影響，并在倒置光學(xué)顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化

10、。
　　2．劃痕實驗檢測 A549及 M-LAC細(xì)胞處理前后遷移能力的變化：各處理組（0、6mg/mL）的細(xì)胞貼壁后應(yīng)用無血清饑餓24h，劃痕，分別于12h、24h時取樣觀察拍照，測量兩組肺癌細(xì)胞的遷移距離。
　　3．采用Transwell實驗法觀察槐耳清膏處理A549及M-LAC前后各組細(xì)胞侵襲能力的變化：各處理組（0、6mg/mL）細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取樣拍照，并計數(shù)其穿膜細(xì)胞數(shù)量。
　　4．分別用含不同濃度（0、2

11、、4、6、8mg/mL）槐耳清膏的培養(yǎng)液培養(yǎng)A549和M-LAC細(xì)胞48h后，采用Annexin V/PI染色法檢測A549和M-LAC這兩組肺癌細(xì)胞凋亡情況。
　　5．Hoechst33258染色法檢測槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）處理 A549及M-LAC細(xì)胞48h后，細(xì)胞發(fā)生凋亡情況。
　　6．采用Western blot法檢測槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）作用48h后，A549和 M-LAC細(xì)胞內(nèi)

12、相關(guān)通路蛋白的變化，檢測指標(biāo)包括β-連接蛋白（β-catenin），上皮標(biāo)記物 E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)記物 Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、Yes相關(guān)蛋白1（YAP1）、磷酸化YAP（P-YAP），B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)基因（Bcl-2）蛋白以及 Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進基因（Bax）蛋白。

13、　　7．采用RT-PCR法檢測槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）處理后 A549和M-LAC細(xì)胞內(nèi)mRNA的變化，檢測指標(biāo)包括MMP-2、MMP-9、VEGFA、TIMP-1、Bcl-2、Bax。
　　結(jié)果：
　　1．CCK-8增殖抑制實驗顯示2mg/mL槐耳清膏作用48h后，人肺腺癌細(xì)胞A549和M-LAC細(xì)胞增殖開始受到抑制（P<0.05），6mg/mL槐耳清膏抑制作用更加明顯（P<0.05），槐耳清膏半數(shù)抑制劑量

14、（IC50）分別為7.01±0.501mg/mL和6.49±0.496 mg/mL。后續(xù)實驗選擇用藥劑量為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL和8mg/mL，藥物作用時間選取48h。
　　2．在倒置光學(xué)顯微鏡下，觀察到不同濃度（0、2、4、6、8mg/mL）槐耳清膏處理48h后，人肺腺癌細(xì)胞A549和M-LAC梭型細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞散在分布。
　　3．劃痕實驗結(jié)果表明6mg/mL槐耳清膏作用24h即可有效抑制人

15、肺腺癌細(xì)胞A549和M-LAC遷移距離，即槐耳清膏有效抑制兩組肺癌細(xì)胞的遷移能力。在A549細(xì)胞中，槐耳清膏作用12h后槐耳清膏組細(xì)胞遷移指數(shù)23.3%，低于對照組56.1%。在M-LAC細(xì)胞中，槐耳清膏處理12h后，槐耳清膏組細(xì)胞遷移指數(shù)為13.3%，對照組為27.6%，差異不明顯；但作用24h后，對照組遷移指數(shù)達(dá)到62.9%，而槐耳清膏組只有26.6%，差異顯著（t檢驗，P<0.01）。
　　4．Transwell侵襲實驗結(jié)果

16、顯示6mg/mL槐耳清膏作用48h即可有效抑制人肺腺癌細(xì)胞A549和M-LAC的穿膜數(shù)量，即兩組肺癌細(xì)胞的侵襲能力都受到抑制，且槐耳清膏對M-LAC細(xì)胞的穿膜抑制作用略高于A549，細(xì)胞穿膜數(shù)目分別為A549空白對照組：344±7.8；6mg/mL槐耳清膏處理組：115±10.8（t檢驗，P<0.01）；M-LAC空白組367±13.1，6mg/mL槐耳清膏處理組54±7.5（t檢驗，P<0.01）。
　　5．流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯

17、示，隨著槐耳清膏劑量的增加（0、2、4、6、8mg/mL，48h），人肺腺癌細(xì)胞的凋亡率也增加，提示槐耳清膏可誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及M-LAC發(fā)生凋亡。其中A549細(xì)胞凋亡率分別為（3.07±0.105）%、（6.167±0.152）%、（9.873±0.307）%、（13.567±0.523）%、（16.643±0.835）%。M-LAC細(xì)胞凋亡率依次為（1.835±0.226）%、（4.573±0.345）%、（8.76±0.

18、657）%、（12.511±0.709）%、（15.084±0.543）%。
　　6．Hoechst33258染色后，鏡下觀察可見人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及M-LAC經(jīng)槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）處理48h后，細(xì)胞發(fā)生了凋亡，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)致密深染，顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞核亮度增加。
　　7．Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌A549和M-L

19、AC細(xì)胞內(nèi) E-cadherin隨用藥劑量的增加表達(dá)升高、Vimentin蛋白表達(dá)水平下調(diào)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。兩組蛋白的變化提示人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞發(fā)生了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)，提示槐耳清膏可能通過抑制人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞的EMT過程抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　8．Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌 A549和 M-LA

20、C細(xì)胞內(nèi) VEGFA、MMP-2、MMP-9的表達(dá)隨著槐耳清膏劑量的增加而下降，TIMP-1則表達(dá)升高，這一結(jié)果提示人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞內(nèi)和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及血管生成相關(guān)的基因隨槐耳清膏劑量增加而發(fā)生相應(yīng)變化，提示槐耳清膏抑制了人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。
　　9．Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞內(nèi)β-cate

21、nin的含量隨用藥劑量的增加而下降。這一結(jié)果提示W(wǎng)nt信號通路受到了槐耳清膏的調(diào)節(jié)。
　　10．Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞內(nèi)P-YAP蛋白水平隨槐耳清膏用藥劑量的增加表達(dá)升高，YAP則表達(dá)下調(diào)。提示在兩組肺癌細(xì)胞中Hippo-YAP通路受到了槐耳清膏的調(diào)節(jié)。另外Western blot結(jié)果及RT-PCR結(jié)果顯示，隨著Bcl-2下

22、調(diào)，bax上調(diào)，提示人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞均發(fā)生了凋亡。這一結(jié)果提示槐耳清膏誘導(dǎo)人肺腺癌A549和M-LAC細(xì)胞的凋亡，且這一凋亡作用可能與Hippo-YAP信號通路調(diào)節(jié)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．槐耳清膏能夠引起人肺腺癌細(xì)胞系 A549和 M-LAC的生物學(xué)行為發(fā)生改變，即槐耳清膏抑制肺癌細(xì)胞的增殖生長、抑制其遷移能力及侵襲能力，誘導(dǎo)兩組肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡?；倍甯鄬-LAC的增殖抑制作用及侵襲能力抑制作用略高于