1、背景：肺癌已經成為引起全球癌癥相關死亡的首要病因，其死亡率占惡性腫瘤死亡的第一位。根據國際癌癥研究中心的報告結果顯示，全球范圍內，由于肺癌造成的死亡人數在不斷增加，截止到2013年，全球肺癌死亡人數約為160萬人，占惡性腫瘤死亡病例的19.4%。目前肺癌的治療采用外科手術為主的綜合療法，但約有80%的肺癌患者確診時已是晚期，經過化療、放療等治療后，晚期肺癌患者的預后差強人意。而術后輔助化療的治療方法雖然已被證實能夠降低復發(fā)率，改善腫瘤患

2、者的生存率，但是增加了其它惡性腫瘤的發(fā)生率，例如卵巢癌、消化道腫瘤及胰腺癌等。近些年來，基因靶向治療漸漸走進人們的視野，但是，這種治療手段并不能有效減輕患者的痛苦還增加了患者的經濟負擔。因此相對天然且毒性小的藥物的研究開發(fā)成為癌癥治療的新課題。這類抗癌藥物副作用少，耐藥性低，成本較其它治療手段低，為癌癥治療提供了新方向。
　　槐耳清膏（Huaier aqueous extract）是一種真菌類的抗腫瘤藥物，它的主要活性成分是槐耳多

3、糖蛋白，是由6個單糖結合18種氨基酸組成的結合蛋白，是一種活性很高的生物反應調節(jié)劑?；倍甯嗑哂姓T導腫瘤細胞分化及凋亡，逆轉腫瘤細胞耐藥性，提高免疫細胞殺傷能力，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力等多靶位抗腫瘤功效?；倍甯喟l(fā)揮其抗腫瘤作用時對正常細胞幾乎沒有損害。已有多項研究發(fā)現，槐耳清膏對肺癌的療效顯著，但具體機制目前尚未闡明。
　　在上皮-間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程中

4、，細胞表面的連接復合物分解消失，導致細胞與周圍細胞和基質的接觸減少，使細胞獲得遷移和穿透間質的能力。EMT過程參與腫瘤細胞的轉移，是腫瘤局部浸潤轉移的關鍵步驟之一。EMT過程受到多種信號通路的調控，其中Wnt/β-catenin通路是誘導上皮組織發(fā)生EMT的關鍵信號通路，其核心成分β-catenin主要參與腫瘤的侵襲轉移和通路下游靶基因如基質金屬蛋白酶9（MMP-9）等的調控。阻斷或逆轉EMT過程對于腫瘤轉移發(fā)揮著重要作用。Hippo-

5、YAP信號通路在維持細胞的增殖/凋亡平衡和組織器官發(fā)育中扮演著重要角色，其核心組分是 YAP。Hippo-YAP通路的異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切，直接或間接作用于Hippo-YAP通路治療腫瘤似乎具有可行性。
　　人肺腺癌細胞系 A549是目前應用最廣泛的人肺腺癌細胞系，1972年通過人肺癌組織移植培養(yǎng)建系，鏡下觀察呈梭形，具有肺泡Ⅱ型上皮細胞的特性和表型。具有雙向轉移潛能的人肺腺癌細胞系M-LAC（Metastastic L

6、ung Adenoarcinoma）是本課題組以人肺腺癌患者的惡性腹水為瘤源建立的，其中50%淋巴道轉移，25%血道轉移。與A549相比，M-LAC少量表達間葉表型標記分子Vimentin，體外侵襲力相對高，腫瘤抑制基因 Rb、p53、促增殖基因 c-myc和血管生成相關因子VEGF-A高于對照組A549細胞。因此，人肺腺癌細胞系A549和M-LAC是研究人肺癌發(fā)生、演進、診斷及治療的一對較為理想的細胞模型。本課題以人肺腺癌A549及M

7、-LAC兩個細胞系為研究對象，研究槐耳清膏對A549及M-LAC兩組細胞系生物學行為的影響并對可能的分子機制進行初步探討。
　　目的：
　　1．檢測槐耳清膏對人肺腺癌細胞系 A549和 M-LAC生長增殖能力、遷移能力、侵襲能力以及凋亡情況的影響；
　　2．檢測槐耳清膏對人肺腺癌細胞系A549及M-LAC細胞EMT過程的影響，即上皮間質轉化標記物 E型鈣黏蛋白（epithelium-cadherin）及間質細胞標志物波

8、形蛋白（Vimentin）的表達；
　　3．檢測β-catenin的變化以探討槐耳清膏對人肺腺癌細胞系 A549及 M-LAC細胞Wnt信號通路的影響；檢測基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、血管內皮生長因子（VEGFA）及基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）在人肺腺癌細胞系 A549及 M-LAC的表達，以探討槐耳清膏對人肺腺癌細胞系A549及M-LAC細胞侵襲、轉移潛能的影響；
　　4．檢

9、測 Hippo-YAP信號通路核心組分 YAP、P-YAP及結合因子 Bax、bcl-2的表達，以探討Hippo-YAP信號通路在人肺腺癌細胞系A549及M-LAC細胞增殖凋亡中的作用。
　　方法：
　　1．培養(yǎng)人肺腺癌細胞A549和M-LAC，CCK-8法檢測不同濃度（0、2、4、6、8、10mg/mL）槐耳清膏作用24h、48h、72h后對A549及M-LAC細胞生長和增殖的影響，并在倒置光學顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)的變化

10、。
　　2．劃痕實驗檢測 A549及 M-LAC細胞處理前后遷移能力的變化：各處理組（0、6mg/mL）的細胞貼壁后應用無血清饑餓24h，劃痕，分別于12h、24h時取樣觀察拍照，測量兩組肺癌細胞的遷移距離。
　　3．采用Transwell實驗法觀察槐耳清膏處理A549及M-LAC前后各組細胞侵襲能力的變化：各處理組（0、6mg/mL）細胞培養(yǎng)24 h后取樣拍照，并計數其穿膜細胞數量。
　　4．分別用含不同濃度（0、2

11、、4、6、8mg/mL）槐耳清膏的培養(yǎng)液培養(yǎng)A549和M-LAC細胞48h后，采用Annexin V/PI染色法檢測A549和M-LAC這兩組肺癌細胞凋亡情況。
　　5．Hoechst33258染色法檢測槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）處理 A549及M-LAC細胞48h后，細胞發(fā)生凋亡情況。
　　6．采用Western blot法檢測槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）作用48h后，A549和 M-LAC細胞內

12、相關通路蛋白的變化，檢測指標包括β-連接蛋白（β-catenin），上皮標記物 E-cadherin、間質標記物 Vimentin、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、血管內皮生長因子（VEGFA）、基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、Yes相關蛋白1（YAP1）、磷酸化YAP（P-YAP），B淋巴細胞瘤-2相關基因（Bcl-2）蛋白以及 Bcl-2基因家族中細胞凋亡促進基因（Bax）蛋白。

13、　　7．采用RT-PCR法檢測槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）處理后 A549和M-LAC細胞內mRNA的變化，檢測指標包括MMP-2、MMP-9、VEGFA、TIMP-1、Bcl-2、Bax。
　　結果：
　　1．CCK-8增殖抑制實驗顯示2mg/mL槐耳清膏作用48h后，人肺腺癌細胞A549和M-LAC細胞增殖開始受到抑制（P<0.05），6mg/mL槐耳清膏抑制作用更加明顯（P<0.05），槐耳清膏半數抑制劑量

14、（IC50）分別為7.01±0.501mg/mL和6.49±0.496 mg/mL。后續(xù)實驗選擇用藥劑量為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL和8mg/mL，藥物作用時間選取48h。
　　2．在倒置光學顯微鏡下，觀察到不同濃度（0、2、4、6、8mg/mL）槐耳清膏處理48h后，人肺腺癌細胞A549和M-LAC梭型細胞體積縮小，細胞皺縮，細胞散在分布。
　　3．劃痕實驗結果表明6mg/mL槐耳清膏作用24h即可有效抑制人

15、肺腺癌細胞A549和M-LAC遷移距離，即槐耳清膏有效抑制兩組肺癌細胞的遷移能力。在A549細胞中，槐耳清膏作用12h后槐耳清膏組細胞遷移指數23.3%，低于對照組56.1%。在M-LAC細胞中，槐耳清膏處理12h后，槐耳清膏組細胞遷移指數為13.3%，對照組為27.6%，差異不明顯；但作用24h后，對照組遷移指數達到62.9%，而槐耳清膏組只有26.6%，差異顯著（t檢驗，P<0.01）。
　　4．Transwell侵襲實驗結果

16、顯示6mg/mL槐耳清膏作用48h即可有效抑制人肺腺癌細胞A549和M-LAC的穿膜數量，即兩組肺癌細胞的侵襲能力都受到抑制，且槐耳清膏對M-LAC細胞的穿膜抑制作用略高于A549，細胞穿膜數目分別為A549空白對照組：344±7.8；6mg/mL槐耳清膏處理組：115±10.8（t檢驗，P<0.01）；M-LAC空白組367±13.1，6mg/mL槐耳清膏處理組54±7.5（t檢驗，P<0.01）。
　　5．流式細胞術檢測結果顯

17、示，隨著槐耳清膏劑量的增加（0、2、4、6、8mg/mL，48h），人肺腺癌細胞的凋亡率也增加，提示槐耳清膏可誘導人肺腺癌細胞系A549及M-LAC發(fā)生凋亡。其中A549細胞凋亡率分別為（3.07±0.105）%、（6.167±0.152）%、（9.873±0.307）%、（13.567±0.523）%、（16.643±0.835）%。M-LAC細胞凋亡率依次為（1.835±0.226）%、（4.573±0.345）%、（8.76±0.

18、657）%、（12.511±0.709）%、（15.084±0.543）%。
　　6．Hoechst33258染色后，鏡下觀察可見人肺腺癌細胞系A549及M-LAC經槐耳清膏（0、2、4、6、8mg/mL）處理48h后，細胞發(fā)生了凋亡，凋亡細胞核呈現致密深染，顯微鏡下可觀察到凋亡細胞核亮度增加。
　　7．Western blot結果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌A549和M-L

19、AC細胞內 E-cadherin隨用藥劑量的增加表達升高、Vimentin蛋白表達水平下調，表現出一定的劑量依賴性。兩組蛋白的變化提示人肺腺癌A549和M-LAC細胞發(fā)生了上皮-間質轉化的逆轉，提示槐耳清膏可能通過抑制人肺腺癌A549和M-LAC細胞的EMT過程抑制腫瘤的侵襲轉移。
　　8．Western blot和RT-PCR結果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌 A549和 M-LA

20、C細胞內 VEGFA、MMP-2、MMP-9的表達隨著槐耳清膏劑量的增加而下降，TIMP-1則表達升高，這一結果提示人肺腺癌A549和M-LAC細胞內和腫瘤浸潤轉移及血管生成相關的基因隨槐耳清膏劑量增加而發(fā)生相應變化，提示槐耳清膏抑制了人肺腺癌A549和M-LAC細胞的浸潤轉移。
　　9．Western blot結果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌A549和M-LAC細胞內β-cate

21、nin的含量隨用藥劑量的增加而下降。這一結果提示Wnt信號通路受到了槐耳清膏的調節(jié)。
　　10．Western blot結果顯示，與對照組相比，槐耳清膏處理組（2、4、6、8mg/mL，48h）人肺腺癌A549和M-LAC細胞內P-YAP蛋白水平隨槐耳清膏用藥劑量的增加表達升高，YAP則表達下調。提示在兩組肺癌細胞中Hippo-YAP通路受到了槐耳清膏的調節(jié)。另外Western blot結果及RT-PCR結果顯示，隨著Bcl-2下

22、調，bax上調，提示人肺腺癌A549和M-LAC細胞均發(fā)生了凋亡。這一結果提示槐耳清膏誘導人肺腺癌A549和M-LAC細胞的凋亡，且這一凋亡作用可能與Hippo-YAP信號通路調節(jié)相關。
　　結論：
　　1．槐耳清膏能夠引起人肺腺癌細胞系 A549和 M-LAC的生物學行為發(fā)生改變，即槐耳清膏抑制肺癌細胞的增殖生長、抑制其遷移能力及侵襲能力，誘導兩組肺癌細胞發(fā)生凋亡。槐耳清膏對M-LAC的增殖抑制作用及侵襲能力抑制作用略高于