1、目的：目前我國診斷的前列腺癌患者仍以晚期患者為主，而對于晚期患者，治療方式仍以內分泌治療為主。在任何內分泌治療過程中，前列腺癌都不可避免地發(fā)展為激素難治性前列腺癌。而激素難治性前列腺癌的治療是目前前列腺癌治療中的重點與難點。雖然各種治療方法層出不窮，從化療到放療，從生物治療到同位素治療，但真正能延長生存的治療方法并不多。腫瘤免疫學認為：腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤逃逸密切相關，而在腫瘤逃逸的因素中，腫瘤細胞自身分泌的免疫抑制因子具有重要作用。其

2、中TGF-β是腫瘤細胞分泌的已知的最強的免疫抑制因子。我們通過用攜帶顯性負相的TGF-βII型受體基因的慢病毒載體感染人CTL，使其對TGF-β不敏感，然后研究對TGF-β失敏感的腫瘤特異性CTL在前列腺癌治療中的作用和意義，為晚期前列腺癌的治療探索一條新的治療途徑。 方法：分三個步驟進行：首先，在已有的pMIG-TβRIIDN(MSCV-RIIDN-IRES-GFP)和pAdTrack-CMV-TK質粒的基礎上制備感染效率高的

3、慢病毒載體，此載體攜帶顯性負相的FGF-βII型受體(dominantnegativeTGF-betatypeIIreceptor)和HSV-tk(herpessimplexvirusthymidinekinase)融合基因，HSV-tk基因主要用于去除多余的淋巴細胞。其次，前列腺根治性切除術時采集新鮮前列腺癌組織標本，分為兩部分，一部分儲存于組織庫，另一部分立即剪成1～2mm的小塊，用基底膜基質(MatrigelBasementMem

4、braneMatrix)進行包埋，1天后種植于4周齡雄性裸鼠前側軀干皮下。待皮下包塊長到1.5cm大小時，取出腫瘤組織塊，再進行裸鼠傳代。當?shù)谌傲邢侔┊惙N移植模型的皮下組織塊長到1.5cm時采集與組織來源同一患者的外周血20ml，然后進行單核細胞體外分離，當天將DC與CTL分開培養(yǎng)。5天后用腫瘤抗原粗提物刺激體外培養(yǎng)的DC細胞，48小時后將DC和CTL細胞混合培養(yǎng)，使CTL具有腫瘤特異性。第三，用慢病毒將顯性負的TβRIIDNgly

5、tk基因導入到腫瘤特異性的CTL細胞，獲得對TGF-β不敏感的同源的腫瘤特異性CTL細胞。第四，以表達TRANSglytk蛋白的CTL作對照，驗證所制備的對TGF-β不敏感的腫瘤特異性的CTL細胞對腫瘤異種移植裸鼠模型所負載的前列腺癌的治療作用。 結果： 1、運用重組PCR技術合成了TβRIIDNglytk及TRANSglytk基因，將此基因用Invitrogen公司的TOPO技術連接到pLenti6/V5-D-TOPO

6、()載體，構建成功了慢病毒表達載體，并經(jīng)過測序驗證；并制備了含有TβSRIIDNglytk及TRANSglytk基因的慢病毒液，病毒滴度分別達到了5.85×106和6.2×106。 2、前列腺癌腫瘤蛋白粗提物能有效刺激DC，進而使CTL細胞具有腫瘤抗原特異性；腫瘤特異性的CTL顯示了與非腫瘤特異性CTL不同的特點；攜帶TβRIIDNglytk或TRANSglytk基因的慢病毒可以有效轉染腫瘤特異性CTL；經(jīng)Westernblot

7、鑒定，表達TβRIIDNglytk蛋白的CTL對TGF-β反應不敏感，而表達TRANSglytk蛋白的CTL卻在TGF-β刺激下出現(xiàn)較強的TGF-β下游蛋白P-Smad2/3的表達；表達TβRIIDNglytk或TRANSglytk蛋白的CTL能被GCV殺滅，提示轉入的HSV-tk基因是有效的，運用此系統(tǒng)可以作為殺滅多余CTL的工具。 3、用裸鼠成功建立前列腺癌異種移植模型，用體外過繼培養(yǎng)得到的對TGF-β不敏感的腫瘤特異性CT