1、臨床免疫檢驗的質量保證,2,,,,第一節(jié) 概述 一、與質量保證相關的定義 二、實驗方法診斷效率評價第二節(jié) 免疫檢驗的質量控制原則 一、標本的正確收集及處理 二、標準化操作及流程 三、標準品和質控品的應用 四、實驗室的環(huán)境、設施和設備第三節(jié) 質量保證、室內質控和室間質評之間的關系,,3,,,,,第四節(jié) 常用免疫檢驗的質量控制 一、免疫檢驗質量控制中常用統(tǒng)計學方法的選擇 二、定性免疫檢驗 三、定

2、量免疫檢驗第五節(jié) 免疫檢驗室內質量控制的數(shù)據處理 一、免疫檢驗質量保證的意義 思考題小結,4,第一節(jié) 概述,為保證病人臨床診療或臨床實驗研究的有效性，臨床實驗室采取一系列有效的措施證明其測定數(shù)據能夠達到所確定的質量標準，這就是質量保證的內容。,5,質量保證(Quality Assurance,QA) 為一產品或服務滿足特定質量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。

3、 室內質量控制（Internal Quality Control,IQC) 由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度。,一、與質量保證相關的定義,6,,室間質量評價 （External Quality Assessment, EQA） 為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機構客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結果,7,,準確度 (accuracy) :待測物的測定值與其真值

4、的一致性程度。偏倚 (bias) 待測物的測定值與一可接受參考值之間的差異。,8,,精密度(precision) 在一定條件下所獲得的獨立的測定結果之間的一致性程度。,9,,準確度好的實驗，其精密度不一定好；準確度差的實驗，其精密度則不一定差；反之亦然。,測定的精密度與準確度之間的關系,10,,重復性條件(repeatability conditions) 是指在短的間隔時間內，在同一實驗室對相同的測定項目使用同一方法和同

5、一儀器設備，由相同的操作者獲得獨立的測定結果的條件。,11,,批 (Run) 在相同條件下所獲得的一組測定。 均值（Mean） 標準差（Standard deviation, SD)變異系數(shù)（Coefficient of variation, CV）,12,,正態(tài)分布(Gaussian distribution) 當一質控物用同一方法在不同的時間重復多次測定，得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲

6、線，又稱高斯分布。,13,,正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學含義可用均數(shù)、標準差（s）和概率來說明。,14,,診斷敏感性（sensitivity of diagnosis） 是指將實際患病者正確地判斷為陽性（真陽性）的百分率。診斷特異性（specificity of diagnosis） 是指將實際無病者正確地判斷為陰性（真陰性）的百分率。,二、實驗方法診斷效率評價,15,,診斷效率（efficiency of diagnosis） 是指能準

7、確區(qū)分患者和非患者的能力。,16,,陽性預測值（（positive predictive value, PPV） 是指特定試驗方法測定得到的陽性結果中真陽性的比率。陰性預示值(negative predictive value, NPV) 是指特定試驗方法測定得到的陰性結果中真陰性的比率。,17,第二節(jié) 免疫檢驗的質量控制原則,18,,標本類型及采集容器標本采集時間及患者準備內源性干擾因素外源性干擾因素,一、標本的正確收

8、集及處理,19,,最常用的標本：血液，包括血清、血漿和全血。唾液或尿液 。建議采用真空采血管及蝶形針具，以免直接接觸血液。采集容器最好為一次性無菌密閉容器。,標本類型及采集容器,20,,,標本采集時間及患者準備,激素和治療藥物感染性病原體抗原、抗體腫瘤標志物特定蛋白,21,內源性干擾因素,,,類風濕因子、補體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等,22,,稀釋標本改變標記抗體用變性IgG預

9、先封閉標本中RF測抗原,可加入還原劑如2-巰基乙醇去除RF使用特異的雞抗體IgY作為標記或固相抗體,類風濕因子干擾的排除,23,,補體干擾,固相抗體和標記二抗可抗體分子發(fā)生變構，從而其Fc段的補體C1q結合位點被暴露出來，這樣C1q就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結果。固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體的抗原表位結合能力，而引起假陰性結果或結果偏低。,24,,補體干擾的排除,56℃ 30min加熱可使標本中補體

10、C1q滅活使用特異的雞抗體IgY作為標記或固相抗體,25,,異嗜性抗體的干擾,天然的異嗜性抗體（IgG）可分為兩類:可結合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域可結合于小鼠、馬、牛和兔IgG的FC區(qū)表位，通過交聯(lián)固相和標記的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應。,26,,異嗜性抗體干擾的排除,使用特異的兔F(ab’)2片段作為固相或標記抗體。在標本或標本稀釋液中加入過量的動物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同

11、時無效。使用靶特異的非Ig親和蛋白（Affibody）替代固相或標記抗體之一。采用噬菌體展示技術展示來自單個金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）聯(lián)合文庫的人IgA結合親和蛋白，用于IgA的測定，不受異嗜性抗體的影響。使用特異的雞抗體作為固相和測定抗體。,27,,抗鼠Ig 抗體的干擾,抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的免疫測定，可產生假陽性結果,28,,使用特異的抗體F(ab’)2片段作為固相或測定標記抗體。 在標本或標本稀釋液中加入過量的

12、鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。 使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應。,干擾排除可采用下述方法:,29,,自身抗體干擾,自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應靶抗原結合形成復合物，在免疫測定方法中可干擾相應抗原抗體的測定。為避免以上情況出現(xiàn)，可在測定前用理化方法將其解離。,30,,溶菌酶干擾,雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和標記的IgG間形成橋接，從而導致假陽性。去除

13、溶菌酶或將其封閉，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其聯(lián)接IgG。,31,外源性干擾因素,溶血、細菌污染、標本貯存時間過長、凝固不全、反復凍融,32,,標本溶血,注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白類似過氧化物的活性，使反應顯色。,33,,標本被細菌污染,細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。,34,,標本貯存時間

14、過長,標本在2~8℃下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性。血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在－70℃以下。,35,,標本凝固不全,血液采集后，離心分離血清沒有完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，易造成假陽性結果血液標本采集后，應使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采

15、血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?36,,冰凍保存標本避免反復凍融,反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。,37,,,試劑準備、標本收集、測定方法和儀器操作寫出“標準操作程序”(SOP),二、標準化操作及流程,38,,標準品和質控品的分類標準品和質控品的基本條件,三、標準品和質控品的應用,39,,,標準品和質控品的分類,標準品即含量確定的處于一定基質中的特性明確的物質。 標準品分級:一

16、級標準品為國際標準品二級標準品為國家標準品二級標準品為商品校準品,40,,臨床免疫檢驗實驗室應有充分合理的空間、良好的照明、空調及濕度維持設備實驗室儀器設備應保養(yǎng)良好，實驗用品要達到相應的要求。,四、實驗室的環(huán)境、設施和設備,41,,第三節(jié) 質量保證、室內質控和室間質評之間的關系,42,,IQC僅覆蓋標本收集、實驗室測定過程和結果報告及其解釋分析步驟；而EQA還包括一個較大范圍的實驗室活動，諸如在標本接收中樣本處理的可靠性，以及

17、測定結果的報告和解釋。QA覆蓋了更寬范圍的活動，最為重要的是標本收集、結果報告和解釋階段。QA還應評價實驗報告的發(fā)出周期（及時性）、完整性和簡潔性。實驗室工作的質量保證在確?；颊咧委熧|量上有重要意義。,43,,,第四節(jié) 常用免疫檢驗的質量控制,免疫檢驗質量控制中常用統(tǒng)計學方法的選擇定性免疫檢驗 定量免疫檢驗,44,,統(tǒng)計學質量控制:使用室內質控物與臨床常規(guī)標本同時檢測，然后根據室內質控物的測定結果，采用統(tǒng)計學的原理方法判斷所進行的臨

18、床常規(guī)標本測定是否在控的一種質量控制措施。,一、免疫檢驗質量控制中常用統(tǒng)計學方法的選擇,45,,,統(tǒng)計學質控的特點,檢驗誤差有兩類：一是系統(tǒng)誤差，一是隨機誤差。系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質控物測定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設備、試劑、標準品或校準物出現(xiàn)問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。隨機誤差則表現(xiàn)為測定SD的增大，主要是由實驗操作人員的操作等隨機因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制。,46,,統(tǒng)計學

19、質控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產生及分析誤差產生的原因，采取措施予以避免。開展統(tǒng)計質量控制前，應將可以控制的誤差產生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內質控的前提，也是保證常規(guī)檢驗工作質量的先決條件。,47,,,基線測定,最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； 當RCV與OCV接近，或小于2 OCV時，則

20、RCV是可以接受的。以上為批間變異。批內變異的測定；室內質控物的測定準確度的評價。,48,臨床免疫檢測質控圖的選擇、繪制及質控結果判斷,,Levey-Jennings質控圖方法,也稱Shewhart質控圖，是由美國的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工業(yè)產品的質量控制。二十世紀五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質量控制 。經Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jenni

21、ngs質控圖。,49,,50,,(1)統(tǒng)計學含義:穩(wěn)定條件下，在20個IQC結果中不應有多于1個結果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結果中超過3SD（99.7%可信限）的結果不多于3個。如以±3s為失控限，假失控的概率為0.3%。,51,,(2)對待質控品應如對待病人標本一樣同等對待，不能進行特殊處理，在每批病人標本測定的同時測定質控品，將所得結果標在質控圖上，質控品在控時，方能報告該批病人標本的測定結果，

22、質控品失控時，說明測定過程存在問題，不能報告病人標本結果，應解決存在的問題，并重新測定在控后方能報告；,52,,（3）當使用一個以上濃度的質控品想在同一張質控圖描點時，則質控圖上均值和s可不標具體數(shù)據，而僅以和s表示； （4）若以均值±2s為失控限，假失控的概率太高，通常不能接受；以均值±3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強。,53,質控圖的記錄,,質控結果日期試劑質控物批號和含量測定者姓名等

23、。,54,,通常質控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質控測定中超出質量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值±1～3SD來表示。 當質控測定值超出控制限L時，即該批測定判為失控。 常用的13S質控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值±3s，其確切的含義為：在質控測定值中，如果有一個測定值超出均值±3s范圍，即可將該批測定判為失控。,質控規(guī)則的表達方式,55,,符 號

24、 定 義12S 一個質控測定值超出±2s控制限。13S 一個質控測定值超出±3s控制限。22S 兩個連續(xù)的質控測定值同時超出+2s或－2s控制限。R4S 同一批測定中，兩個不同濃度質控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。41S 四個連續(xù)的質控測定值同時超出+1s或－1s

25、控制限。7T 七個連續(xù)的質控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變 化。10X 十個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（X）的同一側。,常用質控規(guī)則的符號及定義,56,,Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規(guī)則質控方法,Westgard多規(guī)則質控方法即是將前述的多個質控規(guī)則同時應用進行質控判斷的方法。最初常用的有六個質控規(guī)則，即12S、13S、22S、R4S、41S和

26、10X，其中12S規(guī)則作為告警規(guī)則。13S和R4S規(guī)則反映的是隨機誤差。22S、41S和10X反映的是系統(tǒng)誤差，系統(tǒng)誤差超出一定的程度，也可從13S和R4S規(guī)則反映出來。,57,,在Levey-Jennings質控圖方法的基礎上產生，具有Levey-Jennings 質控圖方法的優(yōu)點，可通過相似的質控圖來進行分析。 假失控和假告警概率低。 誤差檢出能力增強 。,58,,累積和 (CUSUM) 質控方法,累積和 (CUSUM) 質控

27、方法于1977年由Westgard等提出,對系統(tǒng)誤差有較好的測出能力。,59,60,,“即刻法”質控方法,“即刻法” 的實質是一種統(tǒng)計學方法,即Grubs異常值取舍法。 只要有3個以上的數(shù)據即可決定是否有異常值的存在。,61,,已知的弱陽性質控:每次測定都應至少帶一個已知的弱陽性對照，從而有助于判斷臨床標本的檢測結果是否有效。陰性質控:必需,二、定性免疫檢驗質量控制,62,,定量免疫檢驗方法通常需要使用全自動免疫分析儀，由于其對測定

28、結果要求有準確的量值，因此在測定時須用校準品對儀器進行校準.室內質控則應選擇特定試劑盒或方法的測定范圍內的高、中和低三種濃度的質控品，以監(jiān)測對不同濃度標本的測定變化。,三、定量免疫檢驗質量控制,63,,第五節(jié) 免疫檢驗室內質量控制的數(shù)據處理,64,,IQC可確保每次測定與確定的質量標準一致。 EQA的實施，將有力地促進臨床免疫檢驗的標準化。,一、免疫檢驗質量保證的意義,65,,1. 與質量保證相關的定義有哪些，各自的含義是什么？

29、2. 免疫檢驗的質量控制原則是什么？3. 作為標準品和質控品的基本條件是什么？兩者有哪些聯(lián)系和區(qū)別？4. 室間質量評價的概念及意義。5. OCV和RCV的概念。6. 常用免疫檢驗的質量控制方法有哪些？7. 質量保證、室內質量控制和室間質量評價之間的關系。8. 臨床免疫學檢測中常見的干擾因素有哪些？9. 免疫檢驗質量保證的意義。10.實驗方法診斷效率評價的指標有哪些？各自的含義是什么？,思考題,66,,與質量保證相關的定義

30、主要有：質量保證，室內質量控制，室間質量評價，準確度 ，偏倚，精密度，重復性條件，批 ，均值，標準差，變異系數(shù)，正態(tài)分布；與實驗方法診斷效率評價相關的定義有： 診斷敏感性，診斷特異性，診斷效率，陽性預測值，陰性預示值。在免疫測定中，試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色（或測定信號激發(fā)）和測定等每一步驟均對測定結果都可能會產生較大的影響，所有的實驗技術人員在進行相關測定時，必須嚴格按相應的SOP進行操作。,小結,67,,,標準品定值的測定方

31、法可使用參考方法，標準品值的溯源從一級標準的值傳遞到最終試驗所使用的校準物的過程通常由幾個校準步驟組成，包括標準品和測定方法、緩沖液及其基質、稀釋的控制、最終結果的統(tǒng)計學評價和質量控制等。臨床免疫檢測質控圖的選擇、繪制及質控結果判斷包括Levey-Jennings質控圖方法， Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規(guī)則質控方法，累積和質控方法，“即刻法”質控方法。,68,,IQC僅覆蓋上述各步中的測定分析步驟；而EQ