1、背景:
　　下咽癌(Hypopharyngeal cancer)是人頭頸部常見惡性腫瘤之一。這些年來，隨著醫(yī)學診斷技術以及手術技術水平的提高，還有放療、化療、生物治療等綜合治療水平的發(fā)展，患者的生存率卻依然很低。據(jù)國外報道5年生存率僅為15％-30％。首要的原因是下咽癌患者就診時有很大一部分已經(jīng)是中晚期了，很多已經(jīng)有頸部淋巴結的轉移或鄰近部位的侵犯，這主要與該疾病的發(fā)病位置隱秘，不易早期被注意到有關。其次是因為該腫瘤極易轉移及復發(fā)

2、，這也是治療失敗的主要原因。下咽癌的解剖部位注定了其對患者的生活質量、社會交流等重要方面會產(chǎn)生深刻的影響。如果腫瘤復發(fā)，對患者的生存、生活、家庭、經(jīng)濟等各個方面都會產(chǎn)生巨大的消極負面影響。如果可以早發(fā)現(xiàn)、早治療，將有效的改善下咽癌患者的預后。由此可見，探尋下咽癌增殖轉移的可能機制以及與之相關聯(lián)的腫瘤因子，對于臨床工作及患者預后具有十分重要的意義。
　　腫瘤的形成是在一系列突變基因疊加共同作用的、多步驟、多階段的復雜過程。首先在多種

3、類型的癌前組織中，某部分的基因發(fā)生突變，導致這些細胞獲得單克隆或多克隆的生長優(yōu)勢，繼而加上原癌基因、抑癌基因和DNA修復相關基因等發(fā)生一系列突變，更進一步促使癌前細胞轉變?yōu)榘┘毎?，進而形成原發(fā)腫瘤。所謂惡性腫瘤，特點是脫離了原發(fā)的病灶，發(fā)生遠處的擴散、轉移。隨著科技的進步，人們對miRNAs的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中其發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　微小RNA(miRNAs)是一類動、植物以及病毒內(nèi)都普遍存在的，包含

4、21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，與腫瘤的形成及發(fā)展密切相關。有些mi RNA具有致癌基因的功能，大部分具有抑制腫瘤的活性的功能。miRNAs可以識別特定的靶mRNA并與之結合，之后在轉錄后水平抑制翻譯過程和/或促進靶基因mRNA的降解，以此來發(fā)揮其負性調(diào)控基因表達的作用。
　　目前已知的miRNAs已經(jīng)達到千余種。miR-203是miRNAs中的重要一員，具有在上皮組織中特異性表達的特點，其在不同組織來源的惡性腫瘤中的

5、表達有顯著差別。miR-203基因序列定位于染色體上的不穩(wěn)定脆性區(qū)域——14q32.33上，含有52種miRNA基因序列，參與編碼人類目前已知約12％的miRNA。miR-203廣泛地分布于人體的各種組織器官，但是具有組織分布差異性。miR-203在控制細胞增殖、凋亡、分化、祖細胞的干細胞潛力、應激反應、上皮細胞-間充質轉化(EMT)、細胞侵襲和遷移過程中發(fā)揮相關功能。目前研究人員已經(jīng)證明miR-203在一部分腫瘤中發(fā)揮抑癌微小RNA的

6、作用。但是其在下咽癌中的作用特別是對下咽癌增殖轉移機制的影響尚不清楚。
　　平足蛋白/淋巴管內(nèi)皮細胞蛋白(Podoplanin，PDPN)是我們本次實驗鑒定出的miR-203的一個靶基因。平足蛋白是一個小的具有大量O-糖鏈的細胞膜糖蛋白，屬于黏蛋白家族。主要存在于淋巴管內(nèi)皮細胞、Ⅰ型肺泡壁細胞和腎小球足細胞。人類很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)平足蛋白水平升高或表達增加。在大多數(shù)腫瘤中，腫瘤細胞和成纖維細胞平足蛋白表達水平的升高與淋巴轉移發(fā)生率增加

7、和病人生存期縮短有關。平足蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但對PDPN在下咽癌疾病中的研究則非常有限。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-203和PDPN在下咽鱗狀細胞癌組織中的表達水平與腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移、患者的臨床預后之間的相關性尚有待研究。本實驗采用實時定量PCR的方法，測定miR-203和PDPN在人下咽組織和正常黏膜組織中的表達情況，分析miR-203和PDPN與下咽鱗癌的臨床分期、淋巴結轉移之間的關系。同時

8、應用體外實驗通過檢測miR-203和PDPN對FaDu細胞增殖、遷移及侵襲功能的影響，進一步研究兩者的生物學特性和相互作用。以期可以為下咽癌提供早期診斷和預后判斷的分子生物學指標，并可以為下一步的腫瘤靶向治療提供研究方向。
　　本實驗檢測了miR-203在下咽癌組織中的表達情況，研究了miR-203通過調(diào)控靶基因PDPN在下咽癌的轉移及增殖中起的作用，并進一步探討其作用機制。
　　第一部分:miR-203在下咽癌的表達及其對

9、下咽癌發(fā)展的影響
　　目的:
　　1.研究下咽癌組織中miR-203的表達情況以及miR-203的表達量與腫瘤T分期、淋巴結轉移的關系。
　　2.研究miR-203對下咽癌FaDu細胞系增殖、遷移及侵襲的影響。
　　方法:
　　以49例人下咽癌組織及18例正常咽腔黏膜組織為樣本，qRT-PCR（實時定量PCR）法檢測各樣本中miR-203的表達。將腫瘤不同分期及有無淋巴結轉移的各組加以比較分析。再以下咽癌F

10、aDu細胞系為實驗對象，通過包病毒實驗轉染miR-203或miR-NC慢病毒建立穩(wěn)定細胞系。然后經(jīng)qRT-PCR法檢測miR-203的表達。使用細胞計數(shù)試劑Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細胞的增殖活性。運用傷口愈合實驗及體外侵襲實驗證實miR-203過表達的細胞與miR-NC過表達的細胞相比，細胞遷移及侵襲能力的改變。
　　結果:
　　miR-203在正常咽腔黏膜組織中的表達水平顯著高于在下咽癌組織

11、中的表達水平。miR-203表達強度隨著下咽癌組織T分期的增高而降低。同時，通過對比淋巴結轉移及為轉移樣本中miR-203的表達，證實其低表達與腫瘤的淋巴結轉移具顯著相關性。
　　在FaDu細胞中轉染miR-203或miR-NC慢病毒建立穩(wěn)定細胞系，經(jīng)qRT-PCR檢測證實miR-203在miR-203過表達的細胞顯著上升。使用CCK-8每24 h檢測一次細胞活性，實驗結果證實與miR-NC過表達細胞相比，miR-203過表達細胞

12、的細胞增殖活性顯著降低。同時，傷口愈合實驗及體外侵襲實驗均證實miR-203過表達的細胞與miR-NC過表達的細胞相比，細胞的遷移及侵襲能力均減弱。即高水平的miR-203抑制下咽癌細胞的增殖，遷移及侵襲。
　　結論:
　　1.miR-203在下咽癌組織中低表達，并且其表達水平與腫瘤的T分期、淋巴結轉移有關。
　　2.miR-203可以抑制下咽癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　第二部分:miR-203與PDPN

13、在下咽癌組織中的關系研究
　　目的:
　　1.證實PDPN為miR-203的靶基因，并探討兩者的關系。
　　2.探討PDPN在下咽癌組織的表達以及其表達量與腫瘤T分期、淋巴結轉移的關系。
　　3.沉默PDPN，進行CCK-8細胞增殖活性實驗、傷口愈合實驗及體外侵襲實驗，證實PDPN對下咽癌FaDu細胞系增殖、遷移及侵襲功能的影響。
　　4.利用細胞轉染技術，通過比較miR-203過表達以及miR-NC過表達

14、的FaDu細胞分別轉染空載與PDPN后細胞的增殖活性、遷移及侵襲功能，探討PDPN和miR-203的相互作用。
　　方法:
　　通過硅片檢測，使用TargetScan Release7.1分析，鑒別出miR-203結合的PDPN的3'-UTR位點。之后根據(jù)熒光素酶報告基因實驗構建熒光素酶報告基因，包括野生型及突變型。以下咽癌FaDu細胞系為實驗對象，檢測PDPN報告基因野生型及突變型的相對活性。使用qRT-PCR法檢測正常咽

15、腔黏膜組織及人下咽癌組織樣本中PDPN的表達。運用蛋白免疫印跡實驗進一步檢測在miR-203過表達與陰性對照組中PDPN的表達水平。使用細胞計數(shù)實驗檢測細胞的增殖活性。運用傷口愈合實驗及體外侵襲實驗檢測PDPN在各實驗組及對照組中對細胞遷移及侵襲能力的影響。
　　結果:
　　miR-203結合PDPN的位點在3'-UTR區(qū)內(nèi)。在miR-203過表達細胞中，野生型PDPN的報告基因活性很低，而突變型PDPN的報告基因活性在mi

16、R-203過表達細胞、miR-NC對照細胞中一致。人下咽腫瘤樣本中PDPN的表達水平大量超出在正常咽腔黏膜樣本中的表達水平，同時PDPN表達水平的上升與癌癥T分期的上升及淋巴結轉移相關。相關統(tǒng)計分析表明人下咽腫瘤樣本中PDPN與miR-203的表達水平具負相關。蛋白免疫印跡實驗進一步證實與miR-NC對照組相比，PDPN的表達水平在miR-203過表達細胞中下調(diào)。
　　與轉染空載比較，F(xiàn)aDu細胞轉染PDPN shRNA后PDPN

17、表達降低。CCK-8細胞活性檢測證實，與轉染空載比較，PDPN敲除細胞的細胞活性顯著降低。此外，傷口愈合實驗及體外侵襲實驗證明，與對照相比PDPN敲除的FaDu細胞系遷移及侵襲速度明顯降低。
　　蛋白免疫印跡實驗證實，與miR-NC+空載組及miR-203+PDPN組相比，PDPN的表達水平在miR-203+空載組中下調(diào)。CCK-8細胞活性檢測同樣證實miR-203+空載組細胞活性顯著降低。相應的進行傷口愈合實驗及體外侵襲實驗證實

18、miR-203+空載組的細胞的遷移及侵襲速度相比于miR-NC+空載組及miR-203+PDPN組降低。
　　結論:
　　1.PDPN是miR-203的直接下游靶基因。PDPN為重要的原癌基因，其高表達與腫瘤的分期、淋巴轉移密切相關。
　　2.PDPN作為原癌基因促進下咽癌細胞的增殖、遷移及侵襲。miR-203可抑制PDPN在下咽癌細胞中的表達。
　　3.PDPN過表達能夠逆轉miR-203對下咽癌細胞增殖，遷移