1、目的：
　　本課題主要研究了以下內容:
　　1、利用同窩陰性小鼠作為對照小鼠，驗證本實驗中所采用的DMM手術誘導小鼠膝骨關節(jié)炎的效果，以及術后小鼠血清，脾臟和滑膜組織中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的變化情況;
　　2、通過B淋巴細胞特異敲除TSC1，再利用DMM手術建立骨關節(jié)炎模型，闡明在B細胞特異性上調mTORC1對骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程的影響。
　　方法：
　　1、應用由美國Jackson實驗室

2、購買的CD19-Cre小鼠及TSC1-loxP小鼠，利用Cre-loxP系統，我們構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞敲除TSC1的小鼠模型。應用PCR及瓊脂糖凝膠電泳對小鼠進行基因型鑒定。應用western blot技術確定小鼠的敲除效果。
　　2、通過組織學切片染色，即Safranin-O/Fast Green染色和toluidine blue染色，并利用染色結果通過modified Mankin評分系統及對關節(jié)軟骨厚度進行測量，分析在

3、B細胞TSC1缺失后對小鼠膝骨關節(jié)炎的嚴重程度的影響。
　　3、通過免疫組織化學技術(Immunohistochemistry，IHC)觀察在B細胞TSC1缺失后小鼠膝關節(jié)切片MMP-13的表達情況，并利用qPCR技術分析小鼠關節(jié)軟骨中二型膠原和十型膠原的表達量來判斷小鼠關節(jié)軟骨的退化嚴重程度。
　　4、通過ELISA試劑盒檢測分析在B細胞敲除TSC1對小鼠血清中炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNFα在骨關節(jié)炎過程中表達

4、情況的影響。
　　5、通過qPCR技術分析在B細胞敲除TSC1對小鼠膝關節(jié)滑膜及脾臟B淋巴細胞等組織中炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的mRNA表達情況的影響。
　　結果：
　　1、成功構建穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性敲除TSC1小鼠模型。
　　利用Cre-loxP系統成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性TSC1敲除的小鼠(KO mice)。經PCR檢測基因型及western blot檢測B淋巴細胞和骨髓

5、中TSC1及其下游pS6的蛋白表達水平，證實了敲除小鼠的B淋巴細胞確實缺乏TSC1蛋白的表達，且其mTORC1的活性是上升的。
　　2、DMM手術構建骨關節(jié)炎模型效果良好。
　　將同窩陰性對照小鼠(CON mice)分為DMM手術組(DMM group)和假手術組(SHAM group)。分別于術后4周和8周取兩組小鼠的膝關節(jié)進行組織切片，利用Safranin-O/Fast Green染色和toluidine blue染色觀

6、察關節(jié)軟骨的變化情況，同時根據modified Mankin評分系統并對關節(jié)軟骨厚度進行測量。Safranin-O/Fast Green染色結果顯示DMM手術組相對于假手術組modified Mankin評分明顯升高，toluidine blue染色結果表明關節(jié)軟骨厚度明顯變薄。除此之外，分別于術后4周和8周取兩組小鼠膝關節(jié)滑膜組織，利用qPCR技術檢測滑膜組織中炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的mRNA表達。qPCR結果顯示

7、DMM手術組炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的mRNA表達明顯高于假手術組。上述結果證實DMM手術建立骨關節(jié)炎模型效果明顯，且術后膝關節(jié)滑膜組織中炎性細胞因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達水平明顯上調，說明炎性因子參與到骨關節(jié)炎的進展過程中。
　　3、DMM手術后小鼠血清及脾臟B淋巴細胞中炎性細胞因子明顯升高。
　　將CON小鼠分為DMM手術組(DMM group)和假手術組(SHAM group)。分別于術

8、后4周和8周取兩組小鼠的血清，并從脾臟細胞中分離得到B淋巴細胞。利用ELISA技術分析血清中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達情況，發(fā)現DMM手術組血清中炎性因子的表達水平相對于假手術組有所升高。除此之外，利用qPCR技術分析從脾臟細胞中分離所得的B淋巴細胞中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達，qPCR結果顯示DMM手術組與假手術組相比較B細胞中炎性因子的表達水平明顯升高。證實了炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα

9、確實在骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中起到了至關重要的作用。
　　4、KO小鼠與CON小鼠相比炎性因子的表達有所不同。
　　于KO小鼠及CON小鼠出生后16周，取二者的脾臟分離得到B淋巴細胞，并取膝關節(jié)滑膜。利用qPCR技術分析KO小鼠和CON小鼠B淋巴細胞及滑膜中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達情況。qPCR結果分析顯示成年后兩種小鼠膝關節(jié)滑膜中炎性因子的表達無明顯差異，但KO小鼠的B淋巴細胞中炎性因子的表達相對于CON

10、小鼠有明顯升高。通過此結果我們做出假設，由于B淋巴細胞中炎性因子的表達增加，KO小鼠或許能表現出更為明顯的骨關節(jié)炎表型。
　　5、KO小鼠表現出更為嚴重的骨關節(jié)炎表型。
　　基于上述假設，我們選取8周齡的雄性KO小鼠及CON小鼠構建DMM骨關節(jié)炎模型。并于術后4周及8周取膝關節(jié)進行組織切片，同時取關節(jié)軟骨用液氮研磨后用TRIZOL裂解以便提取RNA。膝關節(jié)Safranin-O/Fast Green染色結果顯示術后4周，8周K

11、O小鼠關節(jié)軟骨蛋白多糖丟失明顯且磨損嚴重，modified Mankin評分KO小鼠高于CON小鼠。toluidine blue染色結果表明KO小鼠關節(jié)軟骨厚度明顯低于CON小鼠。膝關節(jié)MMP-13免疫組織化學染色結果顯示KO小鼠陽性細胞明顯多于CON小鼠。關節(jié)軟骨qPCR結果顯示KO小鼠關節(jié)軟骨中二型膠原含量明顯降低而十型膠原含量明顯升高。上述結果均證實了之前的假設，說明KO小鼠相對于CON小鼠在構建骨關節(jié)炎模型后表現出更為嚴重的骨關

12、節(jié)炎表型。
　　6、構建DMM模型后KO小鼠表現出更為嚴重的炎癥反應。
　　除了上述組織切片的分析外，在術后4周和8周我們分別取了KO小鼠和CON小鼠的血清及關節(jié)滑膜。通過ELISA分析血清中炎性因子IL-1β，IL-6，TNFα的表達情況，我們發(fā)現KO小鼠血清中炎性因子的表達水平要高于CON小鼠。利用qPCR技術分析膝關節(jié)滑膜中炎性因子的表達情況我們同樣發(fā)現炎性因子在KO小鼠膝關節(jié)滑膜中的水平要高于CON小鼠。上述結果進一

13、步證實了KO小鼠骨關節(jié)炎程度重于CON小鼠且KO小鼠表現出更為嚴重的炎癥反應。
　　結論：
　　(1)成功構建了穩(wěn)定遺傳的B淋巴細胞特異性敲除mTORC1的上游抑制組分TSC1的小鼠模型。
　　(2)利用同窩對照小鼠驗證了DMM手術構建骨關節(jié)炎模型的有效性。
　　(3)通過DMM手術組與假手術組的對比驗證了炎性因子確實參與到骨關節(jié)炎的發(fā)展過程中。
　　(4)比較KO小鼠與CON小鼠發(fā)現在正常狀態(tài)下二者膝關節(jié)