1、細胞是生命的基本單位，而線粒體是細胞的重要的產(chǎn)能單位，它通過氧化磷酸化合成ATP，為細胞生命活動提供能量。植物線粒體中具有多種交替途徑所介導的能量耗散系統(tǒng)，主要包括末端交替氧化途徑，解偶聯(lián)途徑和交替型NAD(P)H脫氫途徑。交替型NAD(P)H脫氡途徑由一類交替型NAD(P)H脫氧酶催化，能夠催化電子沿電子傳遞鏈傳遞給O2，但是不伴隨質子跨膜梯度形成和ATP產(chǎn)生，因其不能被魚藤酮所抑制，又被稱為魚藤酮非敏感性NAD(P)H脫氫酶。近年來

2、在分離交替型NAD(P)H脫氫酶方面取得了很多進展。對于蛋白質的研究近年宋又成為焦點，在蛋白質復合體水平上的研究，不僅可以揭示未知功能蛋白的功能，還可以在探索己知蛋白在不同復合體中的新的功能。本論文以模式植物擬南芥為研究對象，從擬南芥線粒體可溶性部分中分離到一種具有類似于交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復合體。通過質譜鑒定和蛋白質復合體研究手段確定了該復合體中蛋白質—蛋白質相互作用。取得了以下研究結果：
　　 1.利用Nativ

3、e-PAGE從擬南芥線粒體可溶性部分中分離得到一個具有交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復合體。利用MALDI-TOF質譜鑒定發(fā)現(xiàn)，在這個復合體中除了硫辛酰胺脫氫酶LPD2以外，還存在兩個主要的亞基，N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸還原酶NAGPR和分子伴侶Cpn20，為擬南芥交替型NAD(P)H脫氫酶的研究作出了補充。
　　 2.利用免疫共沉淀技術(co-IP)研究擬南芥NAD(P)H脫氫活性復合體中各亞基之間的相互作用關系。NAGPR

4、抗體免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LPD2和Cpn20可以得到共純化，但是在LPD2抗體免疫共沉淀和Cpn20免疫共沉淀中只分別得到了Cpn20和LPD2，而沒有NAGPR被共沉淀。這些結果說明在這個類似交替型NAD(P)H脫氫酶復合體中，LPD2和Cpn20之間有直接相互作用，而LPD2，Cpn20和NAGPR的之間的相互作用還需要進一步驗證。
　　 3.在煙草瞬時表達系統(tǒng)中進行串聯(lián)親和純化實驗。在煙草瞬時轉染系統(tǒng)中，LPD2-TAPa和NA

5、GPR-TAPa表達水平理想，說明重組的真核表達載體中目的基因沒有發(fā)生任何突變，而且實現(xiàn)了和串聯(lián)親和純化標簽的融合表達。但是在煙草瞬時表達系統(tǒng)中經(jīng)過串聯(lián)親和純化過程得到的LPD2-TAPa和NAGPR-TAPa復合體在western-blot中顯示出顯著的非特異性條帶，這說明煙草瞬時表達系統(tǒng)不適合用來進行外源性蛋白復合體及外源性蛋白質-蛋白質相互作用關系的研究。
　　 4.在擬南芥穩(wěn)定表達系統(tǒng)中進行串聯(lián)親和純化實驗，體內(nèi)分析LP

6、D2，Cpn20和NAGPR之間的相互作用關系。LPD2-ATPa的轉基囚擬南芥全蛋白經(jīng)過IgGBeads純化，SDS-PAGE分離和western-blot檢測，以TPAa-GFP為陰性對照，在LPD2-TAPa復合體中檢測到了Cpn20的存在，但是未檢測到NAGPR；在NAGPR-ATPa的轉基因擬南芥全蛋白經(jīng)過IgG Beads純化，SDS-PAGE分離和western-blot檢測，在NAGPR-TAPa復合體中未檢測到Cpn2

7、0的存在，同時通過TAPa-GFP陰性對照的對比，證實LPD2與NAGPR的結合為非特異性結合，兩者之間沒有特異性相互作用。
　　 以上研究結果表明，在擬南芥線粒體可溶性部分中分離得到的具有交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復合體中，Cpn20作為復合體亞基，和亞基LPD2之間存在特異性相互作用，它們結合在一起，存在于一個復合體中。這是首次揭示他們之間的相互作用。我們推測Cpn20可能協(xié)助LPD2進入線粒體后正確折疊，此外，他們之