1、近年來，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株引起的新型豬流行性腹瀉在世界范圍內暴發(fā)，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。然而，當前防控手段的匱乏無法應對PED帶來的威脅。因此，研究PEDV的致病機理以及開發(fā)抗PEDV藥物對PED的防控和治療具有深遠的意義。
　　本研究基于iTRAQ技術，開展了PEDV強毒株及其傳代致弱毒株感染仔豬空腸組織的比較蛋白質組學分析，為揭示PEDV的致病機理和宿主的免疫應答提供參考。根據蛋白質組學的分析結果

2、，研究了hnRNP A1和PEDVN蛋白的互作關系，為揭示PEDV的復制過程提供參考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并闡明了其抗病毒機理，為PEDV的治療和相關藥物的開發(fā)提供了參考。主要研究內容如下:
　　1.PEDV強毒株及其致弱毒株感染仔豬空腸的蛋白質組學分析
　　本研究使用iTRAQ定量蛋白質技術結合液相二級質譜技術(LC-MS/MS)，研究了PEDV強毒株及其傳代致弱毒株感染仔豬空腸的蛋白質組學變化。在強毒株YN13株

3、感染組和弱毒YN144感染組分別鑒定到269和301個差異表達蛋白。生物信息學分析發(fā)現，差異蛋白主要涉及應激反應，信號轉導和免疫反應等過程。進一步分析發(fā)現，PEDV感染可以導致多種干擾素刺激基因的上調表達，表明PEDV感染會誘導宿主的先天性免疫過程。通過對比分析兩感染組的蛋白，發(fā)現許多熱激蛋白家族成員和一些轉錄翻譯相關因子在兩組中呈現不同的表達情況，提示這可能是造成兩毒株致病性差異的因素。
　　2.核不均一蛋白A1（hnRNP A

4、1）參與PEDV的復制過程
　　根據蛋白質組學結果，發(fā)現hnRNP A1在兩病毒感染組表現為不同的表達情況，提示該蛋白的變化可能會造成病毒致病力的變化。首先研究了該蛋白在細胞中定位情況，通過共聚焦試驗發(fā)現該蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位，表明兩者之間存在互作關系。使用免疫共沉淀技術，進一步確認了兩者之間的互作關系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位區(qū)主要位于核周，而核周是冠狀病毒復制轉錄復合體存在的位置，提示hnRNP A

5、1可能參與了該復合體的組成，進而參與了PEDV的復制過程。為了驗證hnRNP A1是否參與了PEDV的復制過程，通過siRNA沉默hnRNP A1的表達，而后使用不同PEDV毒株感染。通過間接免疫熒光試驗、熒光定量RT-PCR和Western blot試驗發(fā)現hnRNP A1沉默后，PEDV的基因組、PEDV感染的細胞數量以及PEDV N蛋白的表達量都顯著減少，說明hnRNP A1參與了PEDV的復制過程。結合蛋白質組學結果，推測hnR

6、NP A1在YN144感染組的下調表達是造成兩病毒毒力差異的原因之一。
　　3.槲皮素抗PEDV研究
　　通過間接免疫熒光和Western blot試驗，發(fā)現槲皮素可以有效抑制PEDV的感染過程。首先研究了槲皮素對PEDV吸附和入侵過程的影響，發(fā)現其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero細胞，表明槲皮素抗PEDV的作用發(fā)生在病毒入侵宿主細胞之后。由于槲皮素是一種很好的HSPA1抑制劑，其可能通過抑制HSPA1發(fā)揮抗PEDV效果

7、。為驗證此設想，使用siRNA沉默HSPA1的表達，然后再感染PEDV，通過熒光定量RT-PCR、間接免疫熒光和Western blot試驗發(fā)現PEDV的感染過程并未受到影響。表明槲皮素的抗病毒效果并不依賴其HSPA1抑制劑的活性。通過Docking分析，發(fā)現槲皮素可以結合于PEDV3C樣蛋白酶的活性位點，表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表達純化了PEDV的3C樣蛋白酶，通過表面等離子共振(surface plasmon res