1、RNA病毒基因組較DNA病毒難以操作，對其進行研究必須先通過反向遺傳學技術構建其感染性克隆。隨著各類研究方法和實驗技術手段的不斷更新，反向遺傳學技術也在與時俱進，各種新型的回復系統(tǒng)不斷建立。
　　 傳統(tǒng)的基于原核啟動子的回復系統(tǒng)的局限都是感染哺乳細胞時需要通過煩瑣的步驟來產(chǎn)生RNA聚合酶，增加了實驗操作的難度，而且一些產(chǎn)生聚合酶的手段，如使用輔助病毒等，本身就會對實驗有所干擾甚至由于輔助病毒對細胞的病變效應（CPE）會影響負載細

2、胞的生存而導致病毒回復無法進行。真核細胞都可以合成自身的RNA聚合酶，而且這些RNA聚合酶是真核細胞的內(nèi)源蛋白，不需要通過輔助手段（如上述的輔助病毒，輔助質粒，構建細胞系等）去產(chǎn)生就可以啟動真核啟動子的表達，十分方便，也從根本上杜絕了原核RNA聚合酶回復系統(tǒng)利用輔助病毒等對細胞CPE的發(fā)生；另外真核RNA聚合酶有的定位在細胞核，有的定位于細胞質，為回復各種類型的病毒都提供了可能。目前，真核RNA聚合酶回復系統(tǒng)的優(yōu)越性已經(jīng)越來越明顯，成為

3、RNA病毒回復系統(tǒng)的研究熱點。
　　 柯薩奇病毒（Coxsackie virus，CV）是一類常見的經(jīng)呼吸道和消化道感染人體的病毒，屬于微小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus genus）?？滤_奇病毒血清型分A，B兩組，A組有24個血清型，B組有6個血清型，能起一系列的臨床疾病。
　　 科薩奇病毒B組3型（CVB3）基因組為單股正鏈RNA，編碼一個大的開放讀碼框包括2207個氨

4、基酸，兩側為5’非編碼區(qū)（5’-NTR）和3’多聚腺苷非編碼區(qū)。5’-NTR包括一個Ⅰ型核糖體進入位點（IRE）使5’帽子能夠獨立翻譯成病毒多聚蛋白的起始。由于單股正鏈結構，病毒基因組可以被核糖體立即翻譯來產(chǎn)生進行病毒生活周期下一步所需要的多肽。
　　 CVB3的復制不經(jīng)過DNA的中間體，研究其結構和功能比較困難，必須依賴反向遺傳學操作技術得到該病毒的感染性克隆。在感染性克隆的構建過程中，設計一個有效的回復載體是至關重要的。鑒于

5、傳統(tǒng)回復載體的缺陷，本研究設計了一個RNA聚合酶Ⅱ驅動的病毒回復載體。利用CMV啟動子構建CVB3感染性克隆載體：先將質粒pcDNA3.1(+)的CMV啟動子下游區(qū)域通過PCR技術替換成設計好的多克隆位點區(qū)，分別插入PCR合成的HdvRz核心序列和polyA尾片段，形成框架載體pc-H-A，通過瞬時轉染Hela細胞初步鑒定pc-H-A的可用性；同時，為了得到CVB3病毒的全長序列，本研究用我室CVB3（nancy株）感染來Hela細胞，

6、取感染液上清提取病毒RNA，利用長鏈RT-PCR和長鏈PCR技術反復優(yōu)化條件擴增病毒基因組全長片段；最后，將CVB3全長基因組序列克隆至設計好的框架載體pc-H-A中，篩選陽性克隆，并對篩選到的CVB3重組全長克隆其進行測序鑒定和初步回復功能評價。
　　 綜上所述，本研究構建了帶有CMV啟動子的回復框架載體pc-H-A并初步鑒定了該載體可用，利用此框架載體構建了與基因庫中序列相似性為98％的CVB3全長cDNA克隆pc-CVB3