1、Cbl家族是一類具有RING-finger結構域的E3泛素連接酶，在許多物種中都保守存在。Cbl-b蛋白作為E3泛素連接酶和多功能的信號蛋白適配器，能對體內(nèi)外多種刺激產(chǎn)生應答，廣泛參與并調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導。早期有報導認為在T細胞中，Cbl-b通過泛素化胞內(nèi)外受體、受體相關酪氨酸激酶以及下游信號分子從而抑制T細胞活化。因此，Cbl-b作為T細胞活化的限制點使其成為自體免疫疾病和腫瘤治療的分子靶點提供了可能。但Cbl-b抑制T細胞活化的具

2、體分子機制至今還不清楚。
　　miRNA是一組進化保守的小分子RNA，無編碼蛋白質(zhì)的作用，它能通過干擾靶向信使RNA的穩(wěn)定或翻譯而調(diào)節(jié)細胞的各種生物學活動。近年來，通過基因芯片和深度測序技術對T細胞發(fā)育和活化過程中不同階段miRNA的表達譜檢測發(fā)現(xiàn):miRNA在T細胞不同發(fā)育過程及活化前后出現(xiàn)顯著的變化，由此，猜想Cbl-b對CD4+T細胞活化的抑制作用是否通過影響某種特定的miRNA來實現(xiàn)。
　　通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，Cb

3、l-b-/-小鼠的CD4+T細胞在抗CD3抗體的刺激下就可以被活化，而WT小鼠的CD4+T需要抗CD3和抗CD28的抗體同時存在才能被活化。腫瘤接種實驗證明，胰腺癌細胞株Panc02和肺癌細胞株LLC細胞均不能在Cbl-b4-小鼠體內(nèi)有效生長，這些結果和以往報道的研究結果相似，說明Cbl-b抑制了T細胞的活化，且Cbl-b的缺失會抑制腫瘤的生長。為了探索Cbl-b抑制CD4+T細胞活化是否通過調(diào)控特定miRNA表達來實現(xiàn)，我們首先通過M

4、icroarray技術檢測了WT和Cbl-b-/-小鼠CD4+T細胞以及用抗CD3抗體活化的WT和Cbl-b-/-小鼠CD4+T細胞miRNA譜，發(fā)現(xiàn)不管是非活化或活化狀態(tài)下，miR-99a和miR-125b在Cbl-b-/-小鼠的CD4+T細胞中的表達均顯著高于在WT CD4+T。接下來，我們構建了miR-99a和miR-125b過表達質(zhì)粒pMDH1-PGK-GFP-miR-99a和pMDH1-PGK-GFP-miR-125b，并通過

5、qPCR驗證了pMDH1-PGK-GFP-miR-99a和pMDH1-PGK-GFP-miR-125b過表達質(zhì)粒的構建成功，在此基礎上制備了miR-99a和miR-125b逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染小鼠T淋巴細胞系EL4制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。通過CCK8實驗分析發(fā)現(xiàn)，過表達miR-99a或者miR-125b能使CD4+T細胞增殖升高。由此說明Cbl-b可能通過抑制miR-99a/miR-125b表達來抑制CD4+T細胞活化。那么Cbl-b又是如何調(diào)控m

6、iR-99a/miR-125b的表達?為了研究Cbl-b是如何調(diào)控miRNA進而影響CD4+T細胞活化的分子機制，我們查閱文獻找出對miR-99a和miR-125b起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子HOXA10。因此我們構建熒光酶素報告質(zhì)粒，應用熒光酶素報告系統(tǒng)驗證HOXA10與miR-99a和miR-125b的5'UTR結合情況，結果顯示當過表達HOXA10促進miR-99a和miR-125b表達。另外，我們通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在WT小鼠中HO

7、XA10在CD3和CD28的雙信號刺激后才能轉(zhuǎn)位入核，而Cbl-b-/-小鼠則在只有CD3信號刺激時就能入核。這些結果提示Cbl-b缺失后，HOXA10在CD3信號刺激下就可以啟動miR-99a和miR-125b的表達，從而使CD4+T細胞活化。這一結果使我們有理由推測，Cbl-b可能通過HOXA10-miR-99a和miR-125b調(diào)控T細胞活化。
　　為進一步探討Cbl-b如何調(diào)控HOXA10入核，我們應用STRING:fun

8、ctionalprotein association networks預測和Cbl-b、HOXA10相互作用的蛋白，進一步交叉分析發(fā)現(xiàn)相關蛋白SHP-1和SHP-2可能和Cbl-b、HOXA10相互作用。因此我們從WT和Cbl-b-/-小鼠脾臟中用磁珠分選CD4+T細胞，體外活化刺激后提取蛋白，westernblot結果顯示，相對于WT小鼠，Cbl-b-/-小鼠中SHP-2的表達明顯升高，而SHP-1卻沒有明顯變化。同時我們構建了SHP

9、-1，SHP-2的表達質(zhì)粒，在體外我們將SHP-1，SHP-2分別與Cbl-b共表達于293T細胞中，western blot結果顯示，當與Cbl-b共轉(zhuǎn)染時，Cbl-b并未與SHP-2或者SHP-1結合。但我們用抗CD3抗體刺激WT和Cbl-b-/-小鼠中CD4+T細胞后，用Cbl-b抗體進行免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)在TCR/CD3信號刺激下SHP-2和Cbl-b相互作用，可是同時接受CD3/CD28共刺激信號后，SHP-2和Cbl-b的結合

10、減弱。為證明SHP-2在活化后蛋白表達水平的降低是否是由于Cbl-b的E3泛素連接酶的作用，我們刺激活化WT和Cbl-b-/-小鼠中CD4+T細胞，裂解蛋白后對SHP-2進行免疫共沉淀，檢測其泛素化水平，結果顯示在CD3信號刺激后泛素化明顯升高，而同時接受CD28共刺激信號后，泛素化水平又相對降低。同時我們也對SHP-2和HOXA10的相互作用進行了驗證，發(fā)現(xiàn)不管是否活化，SHP-2都與HOXA10結合。通過在體外將SHP-2和HOXA