1、免疫記憶性是機體對外界病原體最有效的抵抗機理，可保證機體再次遇到同一病原體時迅速啟動免疫防御機理消滅病原體，也是疫苗作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。免疫記憶系統(tǒng)由體液免疫記憶和細胞免疫記憶兩部分構(gòu)成，承擔(dān)體液免疫系統(tǒng)記憶功能的為記憶性B細胞(memory B cells,Bm),承擔(dān)細胞免疫系統(tǒng)記憶功能的為記憶性T細胞(memory Tcells,Tm)。人Tm的特征性表面標(biāo)志是CD45RO+，在小鼠體內(nèi)根據(jù)其歸巢部位的不同和表達趨化因子受體不同，Tm

2、分為效應(yīng)型記憶性T細胞(CD44+CD62L-CCR7-）和中樞型記憶性T細胞(CD44+CD62L+CCR7+）。對于記憶T細胞來源存在線性 (或定向)分化和非線性(或不對稱)分化兩種模式。線性分化模式認(rèn)為：初始T細胞先分化為能分泌細胞因子的效應(yīng)細胞，然后其中很少的一部分轉(zhuǎn)化為記憶細胞。另一種觀點認(rèn)為Tm 來源于一類較遲到達免疫應(yīng)答晚期階段的前體細胞。非線性分化模式則認(rèn)為一部分活化的初始T細胞不經(jīng)過效應(yīng)T細胞階段直接分化為記憶細胞。最

3、近的研究表明，記憶細胞的來源更傾向于線性分化模式。體內(nèi)研究證明，與CD8+T細胞不同，IL-7對CD4+Tm的形成起了至關(guān)重要的作用。IL-7-/-小鼠和IL-7R表達突變的小鼠在抗原刺激后不能形成CD4+Tm。在CD4+T細胞反應(yīng)性增殖的高峰期增強IL-7信號，可以促進TCR 轉(zhuǎn)基因小鼠的效應(yīng)CD4+T細胞增殖以及上調(diào)Bcl-2的表達，阻止其在收縮期死亡，從而增加CD4+Tm。在T細胞收縮期注入IL-2,IL-7 或IL-15 都可以

4、使CD8+T細胞收縮期減緩。在收縮期體內(nèi)注入IL-2 或IL-15后，主要積聚的是KLRG1hi CD127 lo的短期存活效應(yīng)和記憶細胞，而注入IL-7 則主要積聚KLRG1lo CD127 hi的長期存活記憶細胞。但體內(nèi)研究只能證明細胞因子對CD4+Tm分化的影響，并不能了解誘導(dǎo)CD4+Tm分化的分子機理。因此人們將CD4+Tm分離出來，研究CD4+Tm 自穩(wěn)性存活和再刺激后增殖的分子機理。研究的靶細胞主要有兩類：小鼠自發(fā)分化的記憶

5、表型T細胞和抗原特異性T細胞。在正常生理條件下，兩類CD4+Tm的自穩(wěn)均需要IL-7和IL-15。記憶表型CD4+Tm的快速增殖還需要MHC-II 類分子，抗原特異性CD4+Tm的快速增殖不需要MHC-II 類分子而主要依賴IL-7。IL-7R 高表達于靜息T細胞，當(dāng)T細胞被激活后，IL-7Ra (CD127)迅速下調(diào)，僅少數(shù)可轉(zhuǎn)化為Tm的效應(yīng)細胞再次表達IL-7Ra。在CD8+T細胞已經(jīng)證明，IL-7Ra的表達對檢測記憶細胞前體很有作

6、用。鑒于目前對CD4+Tm分化主要是體內(nèi)研究，尚無體外模型。為了能深入研究CD4+Tm分化的機理，我們擬首先以流式細胞儀檢測CD44和 CD62L表達作為指標(biāo)，用IL-7 刺激建立體外誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的模型；然后用不同細胞因子或細胞因子組合刺激，觀察其誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的能力；再通過CFSE 標(biāo)記和抗原再刺激驗證體外增殖的細胞確為CD4+Tm；最后以實時熒光定量RT-PCR和Western-blotting等檢測探討CD4+T

7、m 形成的分子機制。
　　 第一部分 體外建立CD4+Tm 生成模型
　　 目的：最初考慮用OT-II小鼠CD4+T細胞來建立本模型。但由于OT-II小鼠飼養(yǎng)困難，數(shù)量不足，所以擬以FBS作為抗原，用野生型C57BL/6小鼠CD4+T細胞來建立本模型，并與OVA 刺激的OT-II小鼠CD4+T細胞比較，證明本模型的實用性。用抗原處理的DC和IL-7在體外刺激初始CD4+T細胞，在不同時間檢測T細胞表達CD44和CD62L

8、的情況和再次抗原刺激增殖情況，建立體外誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的模型，為探討體外誘導(dǎo)CD 4+Tm 生成的條件打下基礎(chǔ)。
　　 方法：無菌條件下分別取OT-II和C57BL/6的股骨和脛骨,提取骨髓細胞在體外分別用FBS 或OVA 刺激，加入IL-4(1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)誘導(dǎo)骨髓來源的成熟DC(mature dendritic cell, OVA-DC或FBS-DC)。無菌條件下分別取OT-II和C57B

9、L/6小鼠脾臟，分離單個核細胞，磁珠分選CD4+T細胞；將OVA-DC與OT-II CD4+T細胞1:10混合，F(xiàn)BS-DC與C57BL/6CD4+T細胞也以同比例混合，用含IL-7(1ng/ml)的10％FBS 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，96孔板每孔1×105細胞，每3天半量換液一次，分別在第5天、10天、15天、20天、25天、30天時，用流式細胞儀檢測CD4+T細胞表面分子CD44,CD62L的表達情況；同時在第30天收集細胞標(biāo)記CFS

10、E后，用OVA-DC 或FBS-D 再刺激，按照 DC：T=1：10的比例將細胞懸液鋪在96孔板中，72小時后用流式細胞儀檢測增殖情況；同時用CFSE 標(biāo)記新鮮分離的OT-II和C57BL/6小鼠脾臟CD4+T細胞，同樣OVA-DC 或FBS-DC 刺激，48小時后用流式細胞儀檢測增殖情況作為對照。
　　 結(jié)果：初始CD4+T細胞多為CD44 lo CD62L hi，隨著培養(yǎng)時間的延長，CD44的表達逐漸升高，CD62L表達降低

11、；OVA-DC 刺激OT-II小鼠CD4+T細胞組高達80％以上，在FBS-DC 刺激C57BL/6小鼠CD4+T細胞組最后CD44 hi CD62L lo細胞比例在70％左右。兩組CD4+Tm表達CD44和CD62L的模式相似；增殖實驗示培養(yǎng)了30天的抗原特異性細胞在再次接觸同種抗原時反應(yīng)快速，細胞分裂大部分聚集在第三代、四代、五代。提示此種方法誘導(dǎo)生成的細胞在表型和功能上都具備CD4+Tm的特征。
　　 結(jié)論：在體外，IL-

12、7 可以誘導(dǎo)CD4+Tm 生成。用FBS 刺激誘導(dǎo)C57BL/6小鼠CD4+Tm 生成的狀況與用OVA刺激誘導(dǎo)OT-II小鼠CD4+Tm 生成的狀況相似，說明可以用野生型C57BL/6小鼠CD4+T細胞代替OT-II小鼠CD4+T細胞進行CD4+Tm 生成機理的研究，所以我們的后續(xù)實驗均用FBS作為抗原研究誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的條件和機理。
　　 第二部分不同細胞因子對體外誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的影響
　　 目的：我們

13、選用細胞因子IL-2,IL-4,IL-7,IL-15,IFN-γ，F(xiàn)lt-3L,TGF-β在體外誘導(dǎo)初始CD4+T細胞，觀察T細胞表型CD44和CD62L的表達情況和再次抗原刺激的增殖情況，探討各種相關(guān)細胞因子分別與CD4+Tm 產(chǎn)生的關(guān)系。
　　 方法：無菌條件下取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨, 提取骨髓細胞在體外用FBS 刺激，加入IL-4 (1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)誘導(dǎo)骨髓來源的成熟FBS-DC。無

14、菌條件下取C57BL/6小鼠脾臟，分離單個核細胞，磁珠分選CD4+T細胞；將C57BL/6小鼠的BMDC與CD4+T細胞1:10混合，分別在含IL-2(50U/ml),IL-7(1ng/ml),IL-15(5ng/ml),IL-4 (10ng/ml),IFN-γ (10ng/ml),Flt-3L(5ng/ml),TGF-β(1ng/ml),IL-7+IL-2和IL-7+IL-15 10％FBS1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，96孔板每孔1×105

15、細胞，每3天半量換液一次，分別在第5天、10天、15天、20天、25天、30天時，用流式細胞儀檢測CD4+T細胞表面分子CD44,CD62L的表達情況；同時在第30天時分別收集存活下來的細胞標(biāo)記CFSE后，用FBS-DC 再刺激，按照 DC：T=1：10的比例將細胞懸液鋪在96孔板中，72小時后用流式細胞儀檢測增殖情況。
　　 結(jié)果：單獨用細胞因子IL-4,IL-15,IFN-γ，F(xiàn)lt-3L,TGF-β等培養(yǎng)的體系中，細胞不到

16、20天全部死亡，而細胞因子IL-2,IL-7,IL-7+IL-2和IL-7+IL-15 培養(yǎng)體系細胞存活下來；隨著培養(yǎng)時間的延長，CD44的表達逐漸升高，CD62L表達降低；另外細胞因子IL-2和IL-7+IL-2 培養(yǎng)體系組其CD44 hi CD62L lo細胞的產(chǎn)生時間在10天左右，而且所占比例遠遠高于其他組；增殖實驗結(jié)果顯示，與其他組相比，IL-2和IL-7+IL-2組的細胞增殖能力顯著減弱，其相互之間無明顯差別；IL-7+IL-

17、15組與單獨IL-7組無明顯差別。提示IL-2只能有效地活化CD4+T細胞，其誘導(dǎo)生成與CD4+Tm表型相符的細胞，但不具備再次免疫應(yīng)答時快速增殖的性能；同時在和IL-7 共培養(yǎng)體系中，有抑制IL-7的功能，導(dǎo)致不能有效誘導(dǎo)CD4+Tm 生成。
　　 結(jié)論：IL-4,IL-15,IFN-γ，F(xiàn)lt-3L,TGF-β等細胞因子單獨在體外不能誘CD4+Tm的生成，同時在IL-7+IL-15培養(yǎng)組與單獨IL-7 培養(yǎng)組無差別；IL-2

18、不能誘導(dǎo)生成CD4+Tm，并且抑制了IL-7 誘導(dǎo)生成CD4+Tm的功能。查閱文獻，未見關(guān)于IL-2能抑制IL-7 誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的報道。由于IL-15 同樣使用IL-2R和γ c作為受體的一部分，且IL-15 并不抑制IL-7誘導(dǎo)的CD4+Tm 生成，說明IL-2的抑制作用可能不是由于通過競爭γ c，而與其他信號途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 第三部分 CD4+Tm 體外生成的分子機制初探
　　 目的：檢測細胞因子IL

19、-7在體外誘導(dǎo)生成CD4+Tm細胞有關(guān)信號分子和凋亡蛋白的表達情況，初步探討IL-7 誘導(dǎo)生成CD4+Tm的機制。
　　 方法：無菌條件下取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨, 提取骨髓細胞在體外用FBS 刺激，加入IL-4(1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)誘導(dǎo)骨髓來源的成熟FBS-DC；無菌條件下取C57BL/6小鼠脾臟，分離單個核細胞，磁珠分選CD4+T細胞；將C57BL/6小鼠的BMDC與CD4+T細胞1:10混

20、合，用分別含IL-7(1ng/ml),IL-2(50U/ml),IL-7+IL-2的10％FBS1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，96孔板每孔1×105細胞，每3天半量換液一次，采用實時熒光定量RT-PCR分別在第5d,10d,15d,20d,25d,30d 檢測細胞因子IL-4,IFN-γ，Bcl-2和Bax mRNA表達水平；另外在培養(yǎng)的第30d 用Western-blotting 檢測STAT5/p-STAT5(Y694),AKT/p-AKT,

21、pro-Caspase-3/ActiveCaspase-3, Bcl-2等分子的蛋白表達水平；同時用剛分離出來的初始CD4+T細胞做相同的檢測。
　　 結(jié)果：與初始CD4+T細胞組相比，IL-7 培養(yǎng)體系的IL-4,IFN-γ，Bcl-2的mRNA表達水平都顯著增高，同時Bcl-2,p-STAT5的蛋白水平增高，Bax，Active Caspase-3的表達降低。提示IL-7 可能通過JAK/STAT信號途徑作用于抗凋亡蛋白Bc