1、背景：眾多動物實驗及流行病學調(diào)查資料顯示,慢性炎癥與腫瘤發(fā)生之間存在因果關(guān)系。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是存在于腫瘤微環(huán)境中的炎癥細胞,在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移起重要作用。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌、參與炎癥的重要細胞因子,可作為腫瘤的促進因子。核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是連接炎癥和癌癥的重要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控細胞增殖、凋亡等相關(guān)基

2、因,參與人類許多腫瘤發(fā)生。
　　 TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB通路是激活NF-κB的通路之一。煤焦瀝青廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)中,是煉焦作業(yè)后產(chǎn)生的副產(chǎn)物,現(xiàn)已被國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為確切致癌物。目前,大多數(shù)研究著重于煤焦瀝青這一單獨因素引發(fā)肺癌機制,而關(guān)于炎癥在其致肺癌的過程中作用如何、機制如何報道較少,

3、需要進一步的研究進行闡明清楚。
　　 課題組前期工作:利用中溫煤焦瀝青煙提取物(Coal tar pitch Volatiles,CTPVs)為染毒物,作用于人支氣管上皮細胞(Human Bronchial Epithelial Cells,BEAS-2B)后,BEAS-2B細胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化;利用BEAS-2B細胞與巨噬細胞的前體人單核細胞系THP-1細胞共培養(yǎng),THP-1細胞可促進CTP誘導BEAS-2B細胞惡性轉(zhuǎn)化;且在細胞

4、的惡性轉(zhuǎn)化中NF-κB p65蛋白及基因表達量升高。在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,該研究欲從THP-1分泌細胞因子TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB方面加以分析,探討炎癥促癌的可能機制,以期為煤焦瀝青所致職業(yè)性肺癌提供早期預防理論依據(jù)及肺癌早期診斷的生物標志。
　　 方法：
　　 1.檢測兩種培養(yǎng)方式的細胞上清TNF-α的表達水平:BEAS-2B細胞與T

5、HP-1細胞共培養(yǎng),兩細胞培養(yǎng)比列為10:1,經(jīng)CTP染毒;單獨培養(yǎng)的BEAS-2B細胞經(jīng)CTP染毒。收集共培養(yǎng)細胞及單獨培養(yǎng)的BEAS-2B細胞代謝液上清,利用ELISA方法檢測不同培養(yǎng)方式細胞上清液中細胞因子TNF-α的表達水平。
　　 2.檢測細胞的惡性轉(zhuǎn)化情況:共培養(yǎng)細胞培養(yǎng)至10代時分為3組:一組加入NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC),為PDTC組;一組

6、細胞加入TNF-α中和抗體,為中和抗體組;一組細胞繼續(xù)培養(yǎng),為對照組。3組細胞同時常規(guī)傳代培養(yǎng)至20代,應(yīng)用流式細胞儀測定細胞周期、軟瓊脂集落形成實驗及染色體數(shù)目畸變分析檢測10代對照組、20代對照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細胞惡性轉(zhuǎn)化指標。
　　 3.檢測基因及蛋白的表達情況:利用Western Blotting檢測10代對照組、20代對照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細胞總蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(

7、TNF receptor-associated factor2,TRAF2)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表達水平及細胞胞核蛋白NF-κB p65的表達水平。利用RT-PCR分別檢測TRAF2、CyclinD1、NF-κB p65 mRNA的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.ELISA測定共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)BEAS-2B細胞代謝液中TNF-α表達水平:結(jié)果顯示共培養(yǎng)細胞較單獨培養(yǎng)細胞在10代、15代、20代

8、、25代、30代時TNF-α的含量高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.細胞的惡性轉(zhuǎn)化情況:
　　 2.1 流式細胞儀測細胞周期:流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn),20代對照組細胞相比10代對照組細胞G1期細胞比例減少(P＜0.05),S期細胞所占比例增加,表明經(jīng)CTPVs染毒的細胞隨著細胞代數(shù)的增加其惡性程度隨之增加。20代中和抗體組與20代PDTC組細胞S期細胞所占比例分別相比與對照組細胞較低,差異有統(tǒng)計學意義

9、(P＜0.05)。
　　 2.2 染色體數(shù)目畸變分析:實驗結(jié)果顯示,在10代對照組細胞中,染色體數(shù)目異常已經(jīng)顯現(xiàn)。20代對照組較10代對照組細胞非2倍體數(shù)目增多;20代中和抗體組、20代PDTC組細胞分別與20代對照組比較,染色體畸變率較低,非2倍體數(shù)目降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.0083)。
　　 2.3 軟瓊脂集落形成試驗:克隆形成以細胞數(shù)目超過50個為標準,10代對照組細胞形成克隆數(shù)在20個左右;20代對照組

10、細胞形成大量克隆,惡性程度增高;20代中和抗體組以及20代PDTC組細胞克隆形成數(shù)目肉眼觀察明顯少于20代對照組;經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn):20代對照組與20代中和抗體組、20代PDTC組細胞相比差異分別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.基因及蛋白的表達情況:
　　 3.1 TRAF2、CyclinD1,NF-κBp65基因表達情況:分別對10代對照組、20代對照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2,Cycl

11、inD1、NF-κBp65mRNA進行比較,結(jié)果顯示,20代對照組細胞NF-κB p65,TRAF2、CyclinD1mRNA相對表達量均高于10代對照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.2 TRAF2、CyclinD1、NF-κB p65蛋白表達情況:分別對10代對照組、20代對照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2、CyclinD1、NF-κB蛋白相對表達量進行比較,結(jié)果顯示

12、,20代對照組胞核蛋白NF-κB p65,總蛋白TRAF2、CyclinD1相對表達量均高于10代對照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：THP-1細胞加速煤焦瀝青煙氣提取物誘導BEAS-2B細胞惡變過程中,THP-1可能通過分泌細胞因子TNF-α發(fā)揮作用;TNF-α與其受體相結(jié)合后可能通過TNFR-TRADD-RIP-TRAF2-IKK-NF-κB通路激活NF-κB,從而發(fā)揮促腫瘤的作用