1、環(huán)境致癌物與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其致癌機制越來越受到廣泛的關注。環(huán)境致癌物可引起機體某些表觀遺傳學的改變，在其所致的腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。其中，microRNAs（miRNAs）已被認為腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵調(diào)節(jié)因素，可通過轉錄后調(diào)控許多基因的表達影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程，促進細胞的惡性轉化和腫瘤的進展。黃曲霉毒素B1(AFB1)是公認的強致癌物，廣泛分布于高濕高熱地區(qū)的各種糧食和飼料中，空氣中的AFB1污染可能與肺

2、癌的發(fā)生有關。AFB1系間接致癌物，可被呼吸系統(tǒng)中高表達的細胞色素P4502A13代謝活化而增強其致癌能力。課題組前期采用0.1 nM AFB1處理高表達CYP2A13的肺支氣管上皮細胞BEAS-2B(B-2A13)50代(P50)可引起惡性轉化，但miRNAs在此過程中的作用及其機制尚不清楚。因此，了解miRNAs在AFB1致B-2A13細胞惡性轉化過程中的作用及其機制有助于全面認識miRNAs在環(huán)境致癌物所致腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用

3、。圍繞上述問題，本研究利用miRNA芯片比較了P50惡性轉化的B-2A13細胞和同期對照細胞的miRNAs表達譜，篩選與細胞惡性轉化相關的關鍵miRNAs;再通過功能研究評價關鍵miRNA在細胞惡性轉化中的作用及其分子調(diào)控機制;試圖為闡明環(huán)境致癌物AFB1與肺癌的關系提供依據(jù)，也為肺癌的預防和控制提供新的生物學標志。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：AFB1誘導的B-2A13細胞惡性轉化相關的關鍵miRNAs的篩選。
　　

4、目的：篩選在P50 B-2A13細胞和P50 B-Vector細胞間差異表達的miRNAs，尋找與AFB1所致細胞惡性轉化相關的關鍵miRNAs。
　　方法：采用Affymetrix miRNA芯片中檢測AFB1持續(xù)處理的惡性轉化的P50B-2A13細胞和同期未轉化的對照細胞(P50 B-Vector)的miRNAs表達譜，比較兩種細胞間差異表達的miRNAs。采用TargetScan軟件預測差異表達的miRNAs的靶基因，分析它

5、們所參與的基因通路，篩選出與細胞惡性轉化及肺癌發(fā)生密切相關的miRNAs，采用RT-qPCR對相關miRNAs進行驗證。最后再采用瞬時轉染miRNAmimics的方法在P50 B-2A13細胞中過表達miR-138-1*、miR-1271、miR-296-3p和miR-708，用細胞增殖實驗和劃痕實驗檢測它們對P50 B-2A13細胞增殖和遷移的影響。
　　結果：⑴Affymetrix miRNA芯片分析:在P50 B-2A13細

6、胞和P50 B-Vector細胞間差異表達的miRNAs有63個，其中上調(diào)的有36個，下調(diào)的有27個。⑵TargetScan軟件預測:初步篩選出差異表達的miRNAs共13個，其中上調(diào)的有7個，分別為miR-432、miR-382、miR-370、miR-335、miR-183、miR-494和miR-421;下調(diào)的有6個，分別為miR-138、miR-138-1*、miR-708、miR-125b-1*、miR-1271、miR-29

7、6-3p。⑶RT-qPCR驗證:RT-qPCR和芯片結果高度相關，除miR-370、miR-138、miR-494外，其余10個miRNAs的表達改變同芯片結果方向一致。⑷細胞增殖:與對照組(miR-Control)相比，miR-138-1*可抑制P50B-2A13細胞的增殖，但miR-1271、miR-296-3p和miR-708對P50 B-2A13細胞的增殖影響不顯著。⑸細胞遷移:測定的4種miRNAs都能抑制細胞的遷移，其中mi

8、R-138-1* mimics處理組的抑制作用最為顯著。瞬時轉染miR-Control、miR-138-1*、miR-1271、miR-296-3p和miR-708的P50 B-2A13細胞的24 h劃痕愈合情況分別為47％、27％、30％、37％和32％。
　　第二部分：miR-138-1*對 AFB1所致的B-2A13細胞惡性轉化的影響及調(diào)控機制。
　　目的：探討miR-138-1*對AFB1所致的B-2A13細胞的惡性

9、轉化過程的影響，分析miR-138-1*調(diào)控的分子機制。
　　方法：采用瞬時轉染的方法改變miR-138-1*或PDK1在P50 B-2A13細胞的表達水平。用體外研究評價miR-138-1*或PDK1對P50 B-2A13細胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成的影響。細胞增殖實驗、劃痕實驗、平板克隆形成、軟瓊脂克隆形成實驗、Transwell遷移實驗、Transwell侵襲實驗、Western blot、RT-qPCR、報告基因?qū)嶒灥?/p>

10、按標準操作程序進行。
　　結果：⑴miR-138-1*對P50 B-2A13細胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成的影響:增加miR-138-1*的表達能顯著抑制P50 B-2A13細胞的增殖、劃痕愈合、克隆形成、遷移和侵襲。⑵miR-138-1*調(diào)控的關鍵靶基因篩選:用RNA22-HAS、MICRORNA.ORG和DIANA-MICROT等軟件對miR-138-1*的靶基因的預測結果以及RT-qPCR、Western blot和雙熒光素

11、酶報告基因?qū)嶒灲燥@示，PDK1可能是miR-138-1*影響P50 B-2A13細胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成的調(diào)控靶基因，miR-138-1*對PDK1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達都具有明顯的抑制作用。⑶PDK1對miR-138-1*表達水平的影響:RT-qPCR檢測顯示，siRNA介導的PDK1在P50 B-2A13細胞的敲除不影響miR-138-1*的表達。⑷miR-138-1*對PI3 K/PDK1/Akt信號通路的調(diào)控:與

12、P0 B-2A13細胞、P50 B-vector細胞和BEAS-2B細胞相比，p-PDK1、p-Akt和p-GSK-3β的表達水平在P50 B-2A13細胞明顯增強，同樣，在過表達miR-138-1*的P50 B-2A13細胞，p-PDK1、p-Akt和p-GSK-3β的表達水平也有減少。⑸PDK1對P50 B-2A13細胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成的影響:在P50 B-2A13細胞中敲減PDK1的表達能明顯抑制細胞的增殖、劃痕愈合、克

13、隆形成、遷移和侵襲。
　　結論：①通過miRNAs芯片和初步的功能驗證，發(fā)現(xiàn)了63個miRNAs與AFB1誘導的B-2A13細胞的惡性轉化有關，由于miR-138-1*能顯著抑制P50 B-2A13細胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成，可能是起關鍵作用的miRNA。②miR-138-1*可以顯著抑制P50 B-2A13細胞PDK1的表達，PDK1是miR-138-1*的靶基因之一。③PDK1介導的PI3K/PDK1/Akt信號通路在惡