1、花生四烯酸(ARA)是人體一種必需的多不飽和脂肪酸,它不僅在營養(yǎng)代謝中起重要作用,而且還被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和飼料等各種領域,有著廣闊的應用前景。但是傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝并不能滿足日益增加的市場需求,需要從分子水平進行改造以提高ARA的發(fā)酵生產(chǎn)水平。
　　 本文首先以高山被孢霉的總RNA為模板,通過PCR反轉錄技術擴增出高山被孢霉延長酶基因(GLELO),將其克隆到simple T Vector,構建重組質粒T-GLELO。由于GL

2、ELO序列上有含有BamH I酶切位點,與要插入pD4質粒所用酶切位點一致,需敲除GLELO因上的BamH I酶切位點,實驗在不改變蛋白質氨基酸序列的前提下,選取370,371和372這3個堿基(GGG)所編碼的Gly進行定點突變將其突變成GGT(Gly)。酶切鑒定和測序結果均表明定點突變成功,得到重組質粒T-GLELO*。
　　 其次,為了使高山被孢霉的延長酶基因實現(xiàn)同源表達,必須在GLELO*上下游加入高山被孢霉能識別的啟動

3、子his H4.1p和終止子trpCt。實驗以pD4質粒為模板,通過PCR擴增出his H4.1-hpt-trpCt片段,并克隆到simple T Vector,得到重組質粒T-his H4.1-hpt-trpCt。再將重組質粒T-his H4.1-hpt-trpCt上的潮霉素基因(hpt)替換成經(jīng)過定點突變的延長酶基因(GLELO*),獲得重組質粒T-his H4.1-GLELO*-trpCt。最后將his H4.1-GLELO*-t

4、rpCt片段再插入到pD4質粒中,獲得重組質粒pD4-GLELO*。
　　 此外,實驗對高山被孢霉原生質體的形成因素和重組pD4-GLELO*的轉化效率進行了考察。結果表明,采用總酶濃度為8 mg/mL,蝸牛酶和纖維素酶1∶1的比例的酶解液在25℃下酶解菌齡為3 d的菌絲3 h后,回收原生質體溶解于以1 mol/L的山梨醇為穩(wěn)定劑的磷酸鹽緩沖液中,可獲得最大的原生質體產(chǎn)量4.16×107個/mg;采用線性化的重組質粒和聚乙二醇P

5、EG4000來介導轉化,原生質體轉化率最高為1.8個/μg。
　　 最后,實驗對轉化成功的高山被孢霉重組菌株進行了初步的搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐實驗。搖瓶實驗結果表明,重組菌株與野生型菌株在生物量和總油脂產(chǎn)量方面沒有較大區(qū)別,但是ARA的產(chǎn)量由3.2 g/L提高到了4.2 g/L,且ARA占總油脂的比例提高了近10％。發(fā)酵罐實驗結果表明,高山被孢霉重組菌株的生物量可達48 g/L,油脂和ARA的產(chǎn)量分別為17.3 g/L和7.9 g/L