1、慢性阻塞性肺?。–OPD）是一種持續(xù)進展的以氣流受限為特征的疾病，嚴重危害人類健康，與接觸有毒顆?；驓怏w的顯著暴露引起的氣道和肺泡異常有關，致殘率和死亡率極高，可造成嚴重的經(jīng)濟負擔，預計2020年將成為全球第三大死亡原因。COPD是可防可治的常見病、慢性病，其急性加重和合并癥嚴重影響患者的預后。因此探索COPD的發(fā)病機制可對該病的預防和治療提供依據(jù)。既往關于COPD的病情發(fā)展主要集中的氣道、肺及肺血管的炎癥反應方面的研究。近年來研究表明

2、，部分 COPD患者即使戒煙，肺內(nèi)炎性反應仍持續(xù)進展，巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等在局部不斷浸潤，暗示 COPD為一種慢性自身免疫性的炎癥性疾病，自身免疫系統(tǒng)的調節(jié)紊亂參與其發(fā)病過程。中性粒細胞和巨噬細胞介導的非特異性反應已證實參與了COPD的發(fā)病過程，但 COPD的詳細的免疫發(fā)病機制仍不清楚，很多證據(jù)表明一些免疫細胞，例如Th17細胞、調節(jié)性T細胞（Treg）和炎癥細胞因子（例如Cav-1，TGF-β，IL-17、IL-10）參

3、與COPD的發(fā)展。細菌和病毒的急性和慢性感染能加重COPD中的炎癥和激活淋巴細胞。大量的證據(jù)表明兩種CD4+T細胞亞群（即Th17細胞和Treg細胞）在炎癥性疾病如COPD，哮喘和特發(fā)性肺纖維化的免疫發(fā)病中起關鍵作用。 Th17細胞具有促炎癥免疫反應的作用且損害組織，Treg細胞能通過各種機制控制炎癥和免疫反應。最近在 COPD和芥子肺病中觀察到Treg和Th17細胞數(shù)量的變化及二者之間的不平衡，并且這種失衡與肺功能相關。
　　小

4、窩（caveolae），是細胞膜表面特化的質膜凹陷結構，主要功能是調節(jié)細胞基本的生理活動，包括轉胞吞作用、信號轉導、內(nèi)吞作用和細胞內(nèi)膽固醇的轉運。小窩蛋白是小窩的結構和功能蛋白，在人體的生理和病理過程中發(fā)揮著更顯著的作用，在人類細胞中目前已確定小窩蛋白家族中有Cav-1、Cav-2及Cav-3共3個成員，其中小窩蛋白-1（Cav-1）是小窩表面高表達且最具標志的蛋白，且作為一個熱門話題，在肺功能障礙的肺中，尤其是呼吸道的纖維化及平滑肌功

5、能等方面被長期的研究。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1能在急性炎癥反應中調節(jié)肺的毛細血管滲漏，在肺水腫和肺損傷中起潛在作用，同時在巨噬細胞，樹突狀細胞（DC），淋巴細胞，外周血單核細胞（PBMC）和血清中可被檢測到。有學者發(fā)現(xiàn)在脂多糖誘導的氣道炎癥中，Cav-1可以通過抑制一氧化氮合酶的表達而減少NO的產(chǎn)生，進一步激活核轉錄因子-kB（NF-kB）的表達來促進氣道炎癥；另有學者的研究結果顯示，Cav-1表達減少能改善多形核中性粒細胞（PMN）

6、活化誘導的肺部炎癥和血管損傷。更重要的研究提示Cav-1的表達在患有哮喘或具有肺高壓的COPD患者的外周血單核細胞或血清中急劇下降。Th17細胞和Treg細胞二者在發(fā)育過程中相互影響，并且Th17和Treg細胞之間存在重要的可塑性。這些特征表明 Th17/Treg平衡在動物模型及人類炎性疾病的發(fā)展和疾病結果中起重要作用，Treg/Th17失衡的概念在許多疾病中被廣泛的研究，包括在COPD中。因此，我們假設Cav-1可以通過調節(jié)Th17/

7、Treg的失衡來促進COPD的發(fā)病過程。
　　在本研究中，我們檢測了對照組及COPD患者外周血和血漿中Cav-1、IL-17、TGF-β的表達水平以及Th17細胞、Treg細胞的百分比，并評估了Cav-1的表達與Treg或Th17細胞的百分比以及Th17/Treg比例之間的關系。
　　目的：
　　Th17和Treg細胞在自身免疫疾病和慢性炎性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著相反的作用，而 Th17/Treg的平衡越來越被重視，二者失

8、衡在慢性炎癥性疾病中具有更顯著的作用，慢性阻塞性肺病是其中之一。小窩蛋白-1已被認為是慢性炎性呼吸道疾病的病理機制中的潛在關鍵調節(jié)蛋白。在本研究中，我們旨在檢測不同時期COPD及肺功能正常吸煙患者體內(nèi)Cav-1的水平，Treg、Th17細胞百分比的變化及其相關細胞因子表達水平，并評估Cav-1的表達與Treg和Th17細胞百分比以及Th17/Treg比值之間的相關性，觀察Cav-1的缺失是否參與COPD中Th17/Treg之間的平衡的調

9、節(jié)。
　　方法：
　　選取2014年8月份至2015年7月份于青島大學附屬醫(yī)院呼吸科就診的肺功能正常的吸煙者23例作為健康對照組（HC）和50例根據(jù)慢性阻塞性肺病全球倡議（GOLD指南）診斷的COPD患者。將50名COPD患者再細分為2組：根據(jù)先前描述的COPD惡化標準診斷的26名急性加重期COPD（AECOPD）患者和24名≥3個月臨床穩(wěn)定期COPD患者（SCOPD）。應用酶聯(lián)免疫吸附測定方法（ELISA）檢測受試者外周血

10、中的Cav-1、IL-17、TGF-β的表達水平；采用流式細胞術檢測對照組及COPD不同時期血液中Th17、Treg細胞的含量以及Th17/Treg的比值，并觀察Cav-1的改變與不同時期COPD患者血液中Th17、Treg細胞以及Th17/Treg比值變化的相關性。將血液中分離出來的PBMC培養(yǎng)24h，將PBMC轉染后48h收獲細胞，并暴露于10％香煙煙霧提取物（CSE）中24h后，通過流式細胞術分析測定CD4+CD25+Foxp3+

11、 Treg細胞和CD4+IL-17+Th17細胞的百分比，并通過ELISA測量TGF-β和IL-17的表達水平，評估Cav-1的表達對COPD患者不同時期的Th17、Treg細胞百分比及其細胞因子IL-17和TGF-β表達的影響。
　　結果：
　　1.臨床資料分析
　　在人口統(tǒng)計學和臨床特征方面對三組受試者進行了比較：年齡、性別和體重指數(shù)（BMI）方面，組之間沒有差異。性別比例不平等主要是由于在中國吸煙者及COPD患者

12、在男性中的流行率高于女性。肺功能測試結果顯示：與對照組（HC）相比，COPD患者的FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred均顯著降低，而RV/TLC與HC組相比顯著升高（P＜0.01）。另外，AECOPD組患者與SCOPD組患者相比，F(xiàn)EV1值降低（P＜0.05）；FEV1/FVC、FEV1%pred顯著降低，RV/TLC顯著升高（P＜0.01）。
　　2. COPD患者血漿中Cav-1的水平和外周血中Treg細胞和Th17

13、細胞的百分比
　　為了研究Cav-1表達水平與Treg和Th17細胞的百分比之間的關系，我們通過ELISA測量血漿Cav-1的表達，以及外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+IL-17+Th17細胞含量的百分比。在穩(wěn)定期COPD（SCOPD）和急性加重期COPD（AECOPD）以及健康對照（HC）受試者中的 FCM，ELISA分析表明，與 HC組相比，COPD患者的Cav-1水平顯著降低（P＜0.01）。SCOP

14、D患者的Cav-1水平明顯低于AECOPD患者（P＜0.05）。除了降低的Cav-1水平，SCOPD組與AECOPD和HC組相比，Treg細胞的百分比顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。而與 SCOPD和 HC組相比，AECOPD組的Th17細胞的百分比顯著增加（P＜0.01）。有意思的是，AECOPD患者外周血中 Treg細胞的百分比顯著低于 HC組。對于 Th17細胞百分比的變化，SCOPD和 HC組之間沒有顯著差異。我們的結果

15、提示 AECOPD患者的 Th17/Treg比值最高，SCOPD患者的Th17/Treg比值與HC組相比顯著下降。
　　3. COPD患者外周血中TGF-β和IL-17的水平
　　患者的增強免疫抑制由 Treg產(chǎn)生的免疫抑制細胞因子 TGF-β的血漿水平的不同增量反映。在SCOPD患者體內(nèi)，TGF-β明顯升高；相比之下，在患有AECOPD的患者中，Th17產(chǎn)生的促炎細胞因子IL-17的外周血水平顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)與循環(huán)中Tr

16、eg和Th17細胞的百分比的變化一致。
　　4. Cav-1表達水平與Treg和Th17細胞的百分比和Th17/Treg比值之間的相關性
　　我們的實驗觀察到 HC組中 Cav-1的水平與 Treg和 Th17細胞的百分比和Th17/Treg的比值沒有顯示任何相關性。COPD患者中 Cav-1水平降低顯示與 Treg細胞的百分比呈負相關，與Th17細胞的百分比和Th17/Treg細胞的比值呈正相關，提示Cav-1水平的變化在

17、COPD患者體內(nèi)Th17/Treg比值失衡中可能起不可忽視的作用。
　　5. Cav-1表達水平的變化影響Treg和Th17細胞的百分比
　　為了評估Cav-1表達的改變是否影響Treg和Th17細胞的百分比，用Cav-1質?；駽av-1-siRNA轉染來自COPD的患者的PBMC，然后暴露于10％CSE24小時，如實驗方法章節(jié)所述。流式細胞術檢測結果分析顯示Cav-1的過表達導致Treg細胞的百分比降低和Th17細胞的百分

18、比增加，而Cav-1的表達的下調促進Treg細胞百分比的升高并降低 Th17細胞的百分比，TGF-β和 IL-17的表達水平的變化規(guī)律與Treg和Th17的百分比的變化規(guī)律一致。
　　結論：
　　1. Treg細胞和Th17細胞及其相關細胞因子均參與了COPD的發(fā)病過程，且兩者在COPD病情發(fā)展過程中的作用相反。COPD患者體內(nèi)存在Th17和Treg細胞比例的失衡，二者比值可以作為COPD疾病進展的標志。
　　2. C

19、OPD患者體內(nèi)的Cav-1表達水平明顯降低。
　　3.血漿Cav-1水平的降低能提高COPD患者外周血中Treg細胞的百分比并降低外周血中Th17細胞的百分比。
　　4. COPD患者中Cav-1的表達水平與Treg細胞的百分比、TGF-β的水平呈負相關，與Th17細胞的百分比、IL-17的水平和Th17/Treg細胞的比值呈正相關。
　　5. Cav-1參與Th17/ Treg之間的失衡，從而破壞COPD患者肺內(nèi)發(fā)生