1、目的：齲病的發(fā)生發(fā)展必須依靠牙菌斑生物膜才能介導(dǎo)和完成，而變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是牙菌斑生物膜中的主要致齲菌。密度感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）是不同種屬細(xì)菌之間的通訊系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜的形成、糖代謝、耐酸能力以及多種毒力因子的分泌。S.mutans的luxS基因編碼的LuxS蛋白是合成其QS系統(tǒng)信號(hào)分子的關(guān)鍵酶。檸檬精油(lemon essential oil，L

2、EO)和橙皮苷（hesperidin，HPN）是由檸檬中提取出的天然產(chǎn)物，檸檬烯（limonene，LIM)是LEO的主要成分。茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，是目前具有代表性的植物防齲藥物。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的液體稀釋法測(cè)量LEO、LIM、HPN及TP作用于S.mutans后，其耐酸性、生物膜形成能力以及l(fā)uxS基因表達(dá)水平的變化，探討LEO等對(duì)S.mutans黏附機(jī)制及毒力因子表達(dá)的影響，為研究天然

3、提取物應(yīng)用于齲病生態(tài)防治提供依據(jù)。
　　方法
　　1.測(cè)定LEO、LIM、HPN及TP對(duì)S.mutans耐酸性的影響
　　測(cè)定四種藥物對(duì)S.mutans的最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），將MIC濃度的四種藥物對(duì)倍稀釋于TPY液體培養(yǎng)基中，每組三個(gè)濃度。以不添加藥物的PH=7-3.5的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將菌懸液與各組培養(yǎng)液按1：10（v/v）比例接種，培養(yǎng)48

4、h，測(cè)定OD值。
　　2.測(cè)定LEO、LIM、HPN及TP對(duì)S.mutans生物膜形成能力的影響
　　將MIC濃度的四種藥物對(duì)倍稀釋于TPY液體培養(yǎng)基中，每組四個(gè)濃度。以不添加藥物的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將菌懸液與各組培養(yǎng)液按1：1（v/v）的比例混合接種于96孔板中，培養(yǎng)48h后取出，測(cè)定OD值。
　　3.測(cè)定LEO、LIM、HPN及TP對(duì)S.mutans的luxS基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組方法同實(shí)驗(yàn)

5、2。將OD為1.0的菌懸液以1∶10(v/v)比例接種于各組，37℃培養(yǎng)18h，提取細(xì)菌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定四組不同藥物處理后S.mutans的luxS基因的表達(dá)量。
　　結(jié)果
　　1.不同濃度的LEO、LIM、HPN及TP對(duì)S.mutans耐酸能力的影響
　　S.mutans在PH=7-3.5的系列TPY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)量不同，在PH=6.5時(shí)生長(zhǎng)達(dá)到峰值；由PH=6-3.5

6、，隨著PH的降低，生長(zhǎng)量下降(F=228.506，P<0.01)；同一PH條件下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)菌生長(zhǎng)量降低。
　　在0.562mg/ml至2.250mg/ml內(nèi)，隨著LEO濃度的增加，細(xì)菌生長(zhǎng)量下降(F=498.266，P<0.01)。
　　在2.62 mg/ml至10.5mg/ml內(nèi)，隨著LIM濃度的增加，細(xì)菌生長(zhǎng)量下降(F=320.600，P<0.01)。
　　在1.0mg/ml至4.0mg/ml內(nèi)，隨著H

7、PN濃度的增加，細(xì)菌生長(zhǎng)量下降(F=327.273，P<0.01)。
　　在0.5mg/ml至2.0mg/ml內(nèi)，隨著TP濃度的增加，細(xì)菌生長(zhǎng)量下降(F=449.599，P<0.01)。
　　在1/2MIC濃度條件下，四種藥物之間兩兩比較，對(duì)S.mutans耐酸性的影響LEO、TP>LIM>HPN(F=524.164，P<0.01)。LEO組與TP組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.不同濃度的LEO、LI

8、M、HPN及TP對(duì)S.mutans生物膜形成能力的影響。
　　在1/2MIC至1/16MIC的濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，四種藥物對(duì)S.mutans生物膜形成的抑制率均呈上升趨勢(shì)。
　　比較1/2MIC濃度下四種藥物對(duì)S.mutans生物膜形成的抑制率，LEO>TP>LIM>HPN，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.777，P<0.01)。
　　3.不同濃度的LEO、LIM、HPN及TP對(duì)S.mutans的luxS基因表

9、達(dá)的影響
　　從0.562mg/ml到2.25mg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著LEO濃度的逐漸升高，luxS基因的mRNA表達(dá)水平從0.7511到0.1218呈下降趨勢(shì)(F=313.600，P<0.01)。
　　從2.62mg/ml到10.5mg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著LIM濃度的逐漸升高，luxS基因的mRNA表達(dá)水平從0.8134到0.1288呈下降趨勢(shì)(F=120.181，P<0.01)。
　　從1.0mg/ml到4

10、.0mg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著HPN濃度的逐漸升高，luxS基因的mRNA表達(dá)水平從0.8697到0.1632呈下降趨勢(shì)(F=196.335，P<0.01)。
　　從0.5mg/ml到2.0mg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著TP濃度的逐漸升高，luxS基因的mRNA表達(dá)水平從0.7440到0.1109呈下降趨勢(shì)(F=243.448，P<0.01)。
　　結(jié)論
　　1. S.mutans的適宜生長(zhǎng)PH值為6.5。在低于MIC

11、濃度范圍內(nèi)，LEO、LIM、HPN及TP均能降低S.mutans的耐酸性，作用強(qiáng)度LEO、TP>LIM>HPN。
　　2. LEO、LIM、HPN及TP在低于MIC濃度范圍內(nèi)，均能抑制牙菌斑生物膜的形成。作用強(qiáng)度LEO>TP>LIM>HPN。
　　3.對(duì)luxS基因表達(dá)的抑制作用LEO、TP>LIM、HPN。不同濃度條件下，LEO和LIM對(duì)S.mutans的luxS轉(zhuǎn)錄表達(dá)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明LIM是LEO抑制lux