1、第一部分 內含子載體質粒的構建和擴增 目的：采用分子生物學方法，運用軟件設計的可動性Ⅱ類內含子位點和引物構建變形鏈球菌comC基因和luxS基因內含子質粒載體，并且擴增產T7RNA酶的質粒pAR1219，為下一步轉導變形鏈球菌、失活comC基因和luxS基因打下基礎。 方法：根據軟件設計結果，comC基因選取兩個靶定位點設計，luxS基因選取三個分值最高的靶定位點設計，合成相應的引物，采用聚合酶鏈反應(PCR)的方法突變

2、Ⅱ類內含子模板，連接產物到線性pACD4K-C質粒中，形成環(huán)狀質粒。將pACD4K-C質粒轉導到大腸桿菌中擴增，擴增后用雙酶切電泳的方法鑒定質粒。 結果：在五種位點設計中，內含子模板突變產物電泳圖均能顯示三條條帶，分別長350bp、300bp、100bp，主要目的片斷為350bp。擴增后的pACD4K-C質粒雙酶切后凝膠電泳顯示350bp和7kb兩條條帶，且質粒穩(wěn)定復制，質粒構建成功。 結論：comC基因的兩種靶定插入位

3、點設計和luxS基因的三種靶定位點設計都能夠成功構建內含子載體質粒。 第二部分 內含子載體質粒轉化變形鏈球菌失活目的基因的實驗研究 目的：將兩種質粒同時轉導到變形鏈球菌，誘導內含子的表達并插入到comC基因和luxS基因的靶定位點中，分別構建comC基因和luxS基因失活株。 方法：同時轉導pACD4K-C質粒和pAR1219質粒到變形鏈球菌中，通過氯霉素和氨芐青霉素的雙重抗性篩選，獲得具有雙重抗性的變型鏈球菌。通過I

4、PTG誘導pAR1219質粒表達T7RNA酶，后者再誘導pACD4K-C質粒內含子的表達，靶定插入到基因位點中，通過接種在卡那霉素篩選培養(yǎng)基上，篩選出內含子成功插入到基因組中的變型鏈球菌菌落，再用colony-PCR法鑒定內含子的正確靶定插入。 結果：在五種靶位點設計中，轉導pACD4K-C質粒和pAR1219質粒后的變形鏈球菌均能篩選出抗25 ug/ml氯霉素和50 ug/ml氨芐青霉素的抗性菌，提示質粒轉導成功。 I

5、PTG誘導作用后，卡那霉素篩選BHI平板上可見按照五種位點設計構建的質粒轉導的變形鏈球菌中均有抗卡那霉素菌落生成。colony-PCR反應確認內含子有無正確插入靶基因位點，在comC基因的兩種設計中，只有68/69位點的設計有目的條帶生成， luxS基因的三種設計中，只有132/133位點設計能夠擴增出目的條帶。 結論：運用可動性Ⅱ類內含子插入目的基因的方法可以高效地獲得穩(wěn)定的變形鏈球茵comC基因和luxS基因失活株，為進一步