1、腫瘤進展過程中常見的上皮細胞間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是一個復雜的逐步發(fā)生的現(xiàn)象，它最主要的標志是E-cadherin的缺失。多個轉錄因子表現(xiàn)出對E-cadherin的轉錄抑制，包括鋅指蛋白Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2和E12/E47。研究發(fā)現(xiàn)有些轉錄因子之間可以相互作用，直接激活下游轉錄因子的啟動序列，共同促進腫瘤細胞發(fā)生EMT轉變。在果蠅體中，Sna

2、il通過抑制shotgun（E-cadherin的同源物）調控胚胎發(fā)育，Snail家族的羧基末端高度保守，介導序列特異性與含有E-box(CAGGTG)的DNA啟動子相互作用，這是其參與EMT的主要結構基礎。鋅指蛋白類轉錄因子ZEB家族結構中均包含2個鋅指簇和連接這兩個鋅指簇的可變序列。ZEB1雙側的鋅指簇必須同時與包含CACCT(G)或CAGGTG(E盒)序列的DNA結合才能發(fā)揮調節(jié)靶基因轉錄的功能。ZEB1可以與E-cadherin

3、編碼基因啟動子上的E2盒[CACCT(G)]結合，抑制E-cadherin的轉錄，誘導細胞發(fā)生EMT。研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細胞EMT過程中存在Sulg對ZEB1的直接調節(jié)，在人乳腺癌細胞系MCF-7的EMT過程中Snail2可以直接激活Twistl的轉錄，EMT過程中轉錄因子之間的相互作用使細胞內信號網(wǎng)絡更為復雜。
　　 試驗首先篩選高表達Snail的細胞系提取總RNA，逆轉錄合成cDNA后運用PCR技術擴增目的基因Snail。試

4、驗中采用TA克隆技術大量擴增目的基因，應用相同限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別切割pEASY-T1-Snaill和質粒pcDNA3.1使其產(chǎn)生相同的粘性末端，用T4DNA連接酶將目的基因與表達載體連接，待測序結果證實目的基因序列正確后，通過轉化大腸桿菌大量抽提質粒pcDNA3.1-Snail。利用陽離子脂質體介導轉染pcDNA3.1-Snail，使Snail在A549肺癌細胞中高表達。結果發(fā)現(xiàn)倒置顯微鏡下A549細胞的形態(tài)更具間質性

5、狀，細胞長梭形，分散存在;劃痕試驗發(fā)現(xiàn)與空白組和對照組相比pcDNA3.1-Snail組細胞愈合速度較快;Western Blotting結果示E-cadherin表達減少，而間質性蛋白N-cadherin，F(xiàn)ibronectin表達上調。為增強試驗說服力，我們在被5ng/ml的TGF-β作用48小時誘導為間質狀態(tài)的腫瘤細胞中感染病毒LV-Snail-RNAi后，發(fā)現(xiàn)敲除Snail后，高表達的N-cadherin和Fibronectin

6、表達下調，而上皮性蛋白E-cadherin被逆轉上調。說明Snail能促進腫瘤細胞發(fā)生EMT轉變，而抑制Snail的表達有可能會阻止或減緩腫瘤細胞的侵襲和轉移。
　　 在研究轉錄因子Snail和ZEB1的調控關系時，我們發(fā)現(xiàn)在A549細胞系中高表達Snail后轉錄因子ZEB1的表達隨之升高，在被TGF-β誘導為間質狀態(tài)的腫瘤細胞中敲除Snail后，被誘導上調的ZEB1又隨之下降。反之，ZEB1并未明顯改變Snail的表達情況。初