1、目的:
　　 研究ZEB1對上皮間質轉化及ESRP1表達的調控機制。
　　 方法:
　　 1.用TGF-β誘導常規(guī)培養(yǎng)的肺癌A549細胞，通過WesternBlotting試驗，檢測相關標志物如ZEB1、ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化。用慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-NC-siRNA感染A549細胞，分四組:LV-ZEB1-siRNA組、LV-NC-

2、siRNA組和用TGF-β刺激48h后再感染LV-ZEB1-siRNA組、LV-NC-siRNA組，WesternBlotting試驗檢測ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化;劃痕試驗和侵襲試驗檢測ZEB1沉默對細胞運動能力的影響。
　　 2.構建ZEB1真核表達載體，轉染A549細胞，WesternBlotting試驗檢測空白對照組（未轉染）、實驗組（轉染pcDNA3.1/myc

3、-His-ZEB1）和陰性對照組（轉染空載體pcDNA3.1/myc-His）中ESRP1、E-cadherin、N-cadherin和fibronectin的變化;劃痕試驗和侵襲試驗檢測ZEB1高表達對細胞運動能力的影響。為進一步研究ZEB1對ESRP1的調節(jié)，構建ESRP1熒光素酶報告基因載體pGL4.17-ESRP1，將重組質粒pGL4.17-ESRP1和pcDNA3.1/myc-His-ZEB1及內參質粒共轉染A549細胞，48

4、h后測定實驗組（重組質粒pGL4.17-ESRP1和pcDNA3.1/myc-His-ZEB1及內參質粒共轉染）、陰性對照組（重組質粒pGL4.17-ESRP1和空質粒pcDNA3.1/myc-His及內參質粒共轉染）和陽性對照組（共轉染6h換液后加入TGF-β刺激）的熒光素酶活性。
　　 結果:
　　 1.(1)經(jīng)TGF-β（5ng/ml）刺激后，A549細胞發(fā)生EMT，E-cadherin和ESRP1表達減少;N-c

5、adherin、fibronectin和ZEB1表達增加。感染ZEB1-siRNA與感染NC-siRNA的細胞相比，ZEB1蛋白的表達受到明顯抑制;而且感染ZEB1-siRNA的細胞，TGF-β刺激導致的上皮標志物E-cadherin和ESRP1的表達減少被逆轉;而間質標志物N-cadherin和fibronectin的表達增加未受明顯影響。
　　 (2)劃痕試驗:與陰性對照組相比，TGF-β組劃痕大部分愈合(P＜0.05);T

6、GF-β刺激后，ZEB1沉默組較陰性對照組遷移速度明顯偏慢(P＜0.05)。
　　 (3)侵襲試驗:與陰性對照組相比，TGF-β刺激后穿膜細胞明顯增多(P＜0.05);TGF-β刺激后，ZEB1沉默組穿膜細胞明顯減少(P＜0.05)。
　　 2.(1)空白對照組、陰性對照組蛋白表達無明顯差異;轉染pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組相比，ZEB1蛋白的表達明顯增多，且上皮標志物E-cadherin和ESR

7、P1的表達減少，而間質標志物N-cadherin和fibronectin的表達未受明顯影響。
　　 (2)劃痕試驗:陰性對照組與空白對照組比較沒有顯著差異（P＞0.05）;pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組比較，遷移速度較快(P＜0.05)。
　　 (3)侵襲試驗:陰性對照組與空白對照組比較沒有顯著差異(P＞0.05);pcDNA3.1/myc-His-ZEB1組與這兩組比較，穿膜細胞明顯增多(P＜0.

8、05)。
　　 (4)熒光素酶試驗:陰性對照組ESRP1啟動子相對熒光素酶活性為0.49±0.038μm，實驗組為0.32±0.063μm，陽性對照組為0.21±0.030μm，說明ZEB1可抑制ESRP1的啟動子活性。
　　 結論:
　　 1.TGF-β可誘導A549細胞發(fā)生EMT。
　　 2.ZEB1表達下調，可使TGF-β刺激導致的上皮標志物E-cadherin和ESRP1的表達減少被逆轉;間質標志

9、物N-cadherin和fibronectin的表達增加未受明顯影響。ZEB1表達增多，可使上皮標志物E-cadherin和ESRP1的表達減少，而間質標志物N-cadherin和fibronectin的表達未受明顯影響。ZEB1可部分抑制EMT過程。
　　 3.ZEB1表達下調可降低A549細胞的遷移能力和侵襲能力，ZEB1高表達可促進A549細胞的遷移能力和侵襲能力，ZEB1可能在惡性腫瘤細胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用。