1、食管癌(esophagealcancer)是人類常見的一種消化道腫瘤，分別占我國和世界惡性腫瘤發(fā)病的第四位和第七位。世界上70％的食管癌發(fā)生在我國，我國是世界上食管癌死亡率最高的國家之一。食管癌患者的五年生存率始終徘徊在10％左右，仍然嚴重威脅著人民的生命和健康。食管癌的治療以外科根治性手術為主，但對于手術不能切除的晚期腫瘤和轉移復發(fā)的腫瘤臨床尚無有效的治療手段，而腫瘤的導向治療可以達到特異地殺傷癌細胞，并盡可能降低對正常細胞的毒副作用

2、，提高抗腫瘤的療效。近10余年來，腫瘤的生物治療已作為一種重要的治療模式被廣泛研究和應用于臨床?？贵w介導的腫瘤免疫顯像和免疫治療是生物治療的重要組成部分，對腫瘤及其轉移的診斷、精確的分期和治療方案的確定均有重要意義。 自1975年Kohler和Milstein成功的制備第一株單克隆抗體以來，單抗的研究經(jīng)歷了鼠源性抗體人源化改造、小分子抗體和抗體展示文庫三個研究階段。其中抗體文庫的出現(xiàn)將基因工程抗體的發(fā)展推向了高潮。 針對

3、鼠源性單克隆抗體在臨床應用中經(jīng)常發(fā)生的異源性問題和導向治療中大分子抗體存在的穿透力較差的問題，我們嘗試應用噬菌體抗體庫技術構建食管癌相關的人源單鏈抗體文庫，并用食管癌細胞對抗體文庫進行了初步篩選。 目的：用基因工程方法和噬菌體抗體庫技術構建人源食管癌單鏈抗體庫，并從中篩選出特異性的單鏈抗體，為食管癌的免疫診斷及免疫治療提供新載體。 方法與結果： 噬菌體抗體文庫的構建：L人源單鏈抗體基因文庫的構建：取食管癌病人癌腫

4、周圍淋巴結作為B細胞的來源，提取淋巴結的總RNA。設計簡并引物，用RT一PCR的方法分別擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因eDNA文庫。首先分別網(wǎng)格篩選確定擴增VH和VL基因片斷的引物對，以cDNA為模板擴增VH和VL基因片斷，再以VH和VL基因片斷為模板分別擴增VH—linker與VL-1inker，然后用SOE—PCR技術將它們拼接后引入酶切位點SfiI和Not工，膠回收PCR產物即得到ScFv基因。結果顯示：食管癌周圍淋巴結總RNA的提

5、取瓊脂糖電泳結果中可見清晰的28S、18S條帶；擴增VH的引物對為HuJH3FOR與HuVN5aBACK；擴增VL的引物對為HuVK5aBACK與HuJK2FOR；擴增VH-1inker的引物對為HuJH4-5Linker與HuVN5aBACK，擴增VL—linker的引物對為HuJK2FOR與Linker-HuVK2-3-6BACK；引入酶切位點的引物為HuJK2FORNot與HuVH5aBACKSfi。Vn基因的大小約為450bp，

6、VL基因為350bp，組裝后的ScFv基因約為850bp。2．單鏈抗體基因文庫與噬菌體載體pCANTAB-5E的拼接：制備轉化效率達到108cfu／ugpUCl8DNA的高濃度電轉菌TGi。單鏈抗體PCR產物經(jīng)SfiI和NotI雙酶切后，膠純化回收。酶切產物與噬菌粒載體pCANTAB-5E連接反應后，電轉化大腸桿菌TGi，結果獲得2×10?cfu／ug氨芐青霉素抗性克隆。隨機進行酶切反應鑒定，陽性插入率為9L7％(22／24)。隨機測序

7、結果證實抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準確插入了載體。3．噬菌體抗體的展示：用2一YT染，在無糖環(huán)境下誘導單鏈抗體片段的噬菌體展示。重組噬菌體的滴度達到10¨cfu／ml。 對噬菌體抗體庫進行初步的篩選及鑒定：L食管癌細胞株對抗體庫的富集：先以懸浮狀態(tài)的正常人食管上皮細胞篩選后再用食管癌細胞Eca1.00和噬菌體抗體庫進行了親和富集，對4輪富集后的噬菌體抗體隨機進行了ELISA檢測，結果顯示：30／85的克隆呈陽性反應。第一

8、輪噬菌體收獲率％為1．15×10一，第四輪噬菌體收獲率％為1．62×10～，第四輪噬菌體收獲率是第一輪的141倍。2．表達可溶性ScFv抗體：強陽性重組噬菌體克隆感染E．coliHB2151，經(jīng)lmmIPTG誘導表達可溶性ScFv抗體。3．親和柱層析純化可溶性抗體：將上述可溶性抗體過HiTrapTMAnti—ETag柱進行親和柱層析，先用中性緩沖洗去未結合抗體，再用酸性緩沖洗脫結合的目的抗體并用堿性緩沖中和，用Azs。檢測，合并峰值高的

9、溶液，進行蛋白定量。4．SDS—PAGE：用12％的分離膠及5％濃縮膠的SDS—PAGE測定上述純化的可溶性抗體分子量的大小，結果顯示分子量為30KD左右。5．Western-blot：免疫印跡實驗表明HRP／anti-Mi3單克隆抗體能使一條分子量為30KD左右的條帶染色。6．免疫組織化學結果提示可溶性抗體僅染食管癌組織，而其它癌組織不染色。7．免疫細胞化學結果表明此可溶性抗體可使食管癌細胞Ecal09染色。8．用細胞ELISA測定可

10、溶性抗體的免疫活性：Eca1.00~osnm為0．73_+0．n，胃癌BGc-823的為0．23+0．08，正常食管上皮細胞(NHEEC)為0．254-0．06，結果顯示可溶性抗體具有較高的特異性，能與Eca1.00細胞結合，而不與胃癌BGc-823和NHEEC結合。結論：針對鼠源性單克隆抗體在臨床應用中經(jīng)常發(fā)生的異源性問題，我們嘗試應用噬菌體抗體庫技術構建食管癌相關的人源單鏈抗體文庫，并用食管癌細胞抗原對抗體文庫進行了初步篩選。結果表