1、目的：構建全人源抗鼻咽癌噬菌體單鏈抗體庫，從抗體庫中篩選抗鼻咽癌的噬菌體單鏈抗體(ScFv)，并對其進行鑒定和測序分析。 方法：體外致敏并用EBV轉化鼻咽癌患者的PBMC。用PCR分別擴增Ⅷ和VL基因并組成ScFv基因。將ScFv基因與載體fuse5連接后，電擊轉化大腸桿菌MC1061，構建噬菌體呈現型ScFv庫。用人鼻咽癌細胞系CNE2及人胚肺成纖維細胞系HFF對初級噬菌體抗體庫進行親和富集phage=-ELISA篩選。篩選獲

2、得的陽性克隆進行ELISA及免疫組化鑒定并測序。 結果：經EBV轉化的3例鼻咽癌患者PBMC，ELISA檢測均有抗鼻咽癌抗體產生，經多次PCR，擴增出6種vH(γ、μ)和9種VL(к、λ)基因，經連接組成54種ScFv基因。將ScFv基因與載體連接后，導入大腸桿菌MC1061。經四環(huán)素抗性篩選，得到庫容量為615×10<'7>的初級噬菌體抗體庫，噬菌體DNA中全長ScFv基因的插入率為100％。用人鼻咽癌細胞系CNE2和人胚肺成

3、纖維細胞系HFF對抗體庫進行三輪正負淘選和富集后，從中隨機挑取828個克隆進行ELISA篩選，得到245個陽性克隆，陽性率為29.6％。將245個陽性克隆進一步進行其他細胞系的ELISA鑒定，發(fā)現克隆F20與三株鼻咽癌細胞系CNE2、HNE2和CNE1均呈陽性反應，而與人胚肺成纖維細胞系HFF、骨髓間質干細胞系HBMSC、原代培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞HUVEC及其他人腫瘤細胞系反應呈弱陽性或不反應。免疫細胞化學結果與細胞ELISA結果基本一

4、致；免疫組織化學結果顯示：與10例人鼻咽癌組織呈不同程度陽性反應，反應部位主要見于胞膜、胞漿，而與5例正常鼻黏膜組織均無陽性反應。對克隆F20進行測序分析，結果表明：克隆F20的重鏈可變區(qū)基因與人胚系IgVH3-23有92.8％的同源性，輕鏈可變區(qū)基因與人胚系IgV4-2有94.2％的同源性；V-D-J 分別屬于VH3-23-D6-6-JH6-linker-V4-2-JL2。 結論：應用體外抗原致敏方法和EBV轉化技術聯(lián)合噬菌體