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文檔簡介
1、目的
探討自噬與凋亡在三鄰甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)誘發(fā)SH-SY5Y細胞神經毒性中的關系,進一步闡述TOCP神經毒性的作用機制。
方法
1.采用RNAi技術,構建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表達載體;將重組質粒轉染SH-SY5Y細胞,G418篩選出Beclin1穩(wěn)定低表達的SH-SY5Y細胞系(sh-Beclin1細胞系),RT-
2、PCR與Western blot檢測sh-Beclin1細胞系Beclin1基因的mRNA與蛋白表達。
2.不同濃度TOCP(0,0.5mM)分別處理SH-SY5Y細胞與sh-Beclin1細胞48h,MDC染色觀察兩組細胞系自噬泡的數量變化,Western blot檢測兩組細胞中LC3-II蛋白的表達。
3.不同濃度 TOCP(0,0.25,0.5,1.0mM)分別處理 SH-SY5Y細胞與sh-Beclin1細胞
3、48h,Hoechst33258染色觀察兩組細胞系細胞核形態(tài),流式細胞儀檢測兩組細胞系細胞周期的變化,Western blot檢測兩組細胞系凋亡相關基因Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白的表達。
結果
1.測序證實pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表達載體構建成功。熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Western blot技術鑒定Beclin1基因穩(wěn)定敲減SH-SY5Y細胞系建立成功。
4、 2.MDC染色結果和Western blot結果顯示,與對照組SH-SY5Y細胞比較, TOCP(0.5mmol/L)處理sh-Beclin1細胞系48h后,產生自噬泡的數量明顯減少, LC3-II蛋白表達明顯降低。
3.與對照組SH-SY5Y細胞比較,sh-Beclin1細胞經不同濃度TOCP(0,1.0mM)處理48h后進行Hoechst33258染色,在熒光顯微鏡下可見細胞核藍色熒光增強,染色質聚集明顯,且有部分細胞出
5、現細胞核碎裂、溶解,細胞出現典型的凋亡現象,且產生核碎裂的細胞數量隨TOCP濃度升高而增加。
4.不同濃度的TOCP(0,0.25,0.5,1.0mM)處理SH-SY5Y細胞和sh-Beclin1細胞48h后,流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示:與對照組SH-SY5Y細胞比較,sh-Beclin1細胞 G1期前有亞二倍體凋亡峰的出現,并凋亡細胞數量隨著TOCP濃度增高而增多,并呈現劑量-效應關系(P<0.05)。
5.不
6、同濃度的TOCP(0,0.25,0.5,1.0mM)處理SH-SY5Y細胞和sh-Beclin1細胞48h后,Western blot檢測凋亡相關蛋白結果顯示:在SH-SY5Y細胞中,凋亡相關蛋白bcl-2/bax比值無升高或降低趨勢,Cleaved-caspase-3蛋白表達無顯著變化,在sh-Beclin1細胞中,凋亡相關蛋白bcl-2/bax比值呈降低,并呈劑量-效應關系(P<0.05),cleaved-caspase-3蛋白表達
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