1、為了驗證A-N文庫篩選的結果，我們對文庫中代表性基因的mRNA表達水平進行了檢測。我們選擇了文庫中出現(xiàn)次數相對較多的REG4、PERP、YWHAZ及KLF4基因，采用SYBR Green熒光定量PCR方法在8例結直腸正常黏膜-腺瘤-腺癌(N-A-T)配對組織，49例結直腸正常黏膜-腺癌(N-T)配對組織中檢測其mRNA的表達水平。 結果顯示在受檢的8例N-A-T配對、49例N-T配對樣本中，REG4在7例腺瘤，23例腺癌中的表達

2、高于配對正常黏膜(中位表達倍數分別為2.263、0.982)，并在6例N-A-T配對組織腺瘤中的表達高于正常黏膜及腺癌。其在腺瘤中的表達顯著高于配對正常黏膜(p=0.036)。PERP在6例腺瘤，39例腺癌中的表達高于正常黏膜(中位表達倍數分別為2.146、1.941)，并在5例N-A-T配對組織的腺瘤中的表達高于正常黏膜及腺癌。PERP在腺瘤及腺癌中的表達均顯著高于配對正常黏膜(p=0.036，p=0.000)。YWHAZ在5例腺瘤，

3、31例腺癌中的表達高于正常黏膜(中位表達倍數分別為1.339、1.200)，其在4例N-A-T配對組織的腺瘤中的表達高于正常黏膜及腺癌，其在腺癌中的表達顯著高于配對正常黏膜(p=0.03)。KLF4僅在2例腺瘤，4例腺癌中高表達(中位表達倍數分別為0.521、0.230)，而其在腺癌中表達顯著低于配對正常黏膜(p=0.000)。至此，A-N文庫篩選出的在結直腸腺瘤中高表達的基因得到了較好的驗證。加上前期已驗證的6個核糖體蛋白基因及C6o

4、rf37基因，體現(xiàn)了SSH方法的可靠性。 鑒于PERP是新近發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉移細胞系中低表達的新基因，可能是p53下游的效應分子。因此，我們對在結直腸腺瘤及腺癌中均顯著高表達的PERP基因進行了表達及功能的深入研究。首先，利用組織芯片(TMA)結合RNA原位雜交(ISH)和免疫組化(IHC)技術，分別從mRNA及蛋白水平檢測了PERP在結直腸組織中的表達情況。結果顯示，PERP mRNA在結直腸正常黏膜的隱窩下部表達較上部高，其在結

5、直腸正常粘膜、腺瘤及腺癌組織中表達率分別為62.5％，97.6％，88.9％。PERP在結直腸腺瘤、腺癌組的表達顯著高于正常粘膜組(p=0.000，p=0.000)，腺瘤與腺癌組無顯著差異(p=0.249)，其在腺瘤及腺癌中的表達顯著高于配對正常黏膜(p=0.046，p=0.000)。PERP蛋白在正常結直腸黏膜、腺瘤及腺癌組織中表達率分別為67.7％，84.2％，81.5％。腺瘤與腺癌組的表達顯著高于正常黏膜組(p=0.001，p=0

6、.001)，腺瘤組與腺癌組間無顯著差異(p=0.564)。PERP蛋白在腺癌中的表達顯著高于其配對正常黏膜(p=0.000)。為了探究PERP表達與p53蛋白表達的關系，我們對同批組織芯片進行了p53蛋白的檢測。統(tǒng)計結果顯示，p53蛋白在正常結直腸黏膜、腺瘤及腺癌組織中表達率分別為3.17％，78.10％，71.90％。腺瘤組及腺癌組中的表達顯著高于正常黏膜組(p=0.000，p=0.000)，腺瘤與腺癌組間差異不顯著(p=0.170)

7、。其在腺癌中的表達顯著高于配對正常黏膜(p=0.000)。隨后，我們進行的相關性分析發(fā)現(xiàn)，PERP mRNA及蛋白水平與p53蛋白水平均成正相關，相關系數分別為r=0.452(p=0.000)；r=0.341(p=0.000)。 為探討PERP在結直腸腫瘤中的可能作用，我們構建含有PERP全長編碼區(qū)的真核表達型質粒PcDNA3.1-PERP CDs，對不表達或低表達內源性PERP基因的結直腸癌LoVo和RKO細胞株進行了基因轉染

8、，并檢測了轉染PERP后的生物學效應。通過G418藥物篩選，我們得到穩(wěn)定表達外源性PERP的LoVo-CDs和RKO-CDs細胞株。MTT細胞增殖能力檢測結果顯示：轉染PERP能促進LoVo和RKO細胞株的生長(p=0.000,p=0.058)。PI單染，PI/Annexin V雙染的流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)：轉染PERP對LoVo和RKO細胞株的凋亡和周期無明顯影響。檢測細胞遷移能力的劃痕實驗顯示轉染PERP基因，增強了LoVo細胞株的遷移

9、能力。 但是，由于構建A-N文庫時使用的是來源于一個病例的樣本，造成了篩選結果的偏倚。如我們發(fā)現(xiàn)KLF4基因Q-PCR的驗證結果與文庫篩選結果相反。但是，新近不少研究發(fā)現(xiàn)KLF基因家族與細胞的分化成熟有關，已成為癌癥研究中的熱點。腸道由于其黏膜隱窩的增殖-分化動力學，成為研究細胞分化成熟的良好模型。我們Q-PCR的結果顯示KLF4在正常黏膜-腺瘤-腺癌中的表達依次降低，該現(xiàn)象不僅提示了KLF4基因的表達與細胞分化成熟相關，更支持

10、了長期存在的“腫瘤是細胞分化紊亂或逆向分化”的理論，引起我們極大興趣。因此，我們對KLF4在結直腸中的表達情況進行了比較全面的臨床病理研究。 首先，我們利用免疫組織化學方法檢測了KLF4蛋白在結直腸組織中的表達及分布情況。由于KLF4可能與細胞分化成熟相關，在分析免疫組化結果時，我們將結直腸黏膜隱窩分成上1/2和下1/2進行精細定量分析。我們發(fā)現(xiàn)，所有的(73/73)的結直腸正常黏膜均表達KLF4，KLF4+細胞主要位于隱窩上部

11、。隱窩上1/2陽性細胞數(35.7％±19.0％)顯著高于隱窩下1/2(11.4％±9.8％)(p<0.01)。在結直腸腺瘤，雖然KLF4+細胞數顯著低于正常黏膜，但其分布模式與正常黏膜相似，異形增生的隱窩上1/2陽性細胞數(19.7％±20.5％)顯著高于下1/2(9.0％±13.4％)(p<0.01)。腺瘤KLF4+細胞(15.0％±16.3％)顯著低于瘤旁殘留黏膜(30.6％±13.5％)。而腺癌中，KLF4彌散表達，總體陽性率僅

12、3.0％±6.72％，顯著低于配對癌旁殘留黏膜(2.0％±4.6％vs23.4％±11.5％)(p<0.01)。從整體來看，KLF4蛋白在正常黏膜(23.5％±13.0％)、腺瘤(15.0％±16.3％)、腺癌(3.0％±6.72％)中的表達依次降低，且差異均顯著(p<0.01)。結直腸正常黏膜、腺瘤、腺癌KLF4陽性率分別為100％(73/73)，58.3％(28/48)、38/129(29.5％)。腺瘤與腺癌的陽性率顯著低于正常黏膜

13、(p<0.001)。低級別腺瘤中KLF4陽性率(26/39)顯著高于高級別腺瘤(2/9)(p<0.01)。在大于60歲或腫瘤芽較多(≥15)的結直腸癌病例中表達顯著下降(p<0.01，p<0.01)。KLF4表達陽性病例總體生存率(76.3％，29/38)高于KLF4陰性病例(68.1％，62/91)，陽性病例5年生存率(67.9％，19/28)高于陰性病例(51.7％，30/58)(p=0.172)，陽性病例的5年累積生存率高于陰性病

14、例(74％vs 63％，p=0.379)。在發(fā)生淋巴結轉移的病例中，KLF4表達陽性的預后相對陰性的病例較好(p=0.252)。 為了探討KLF4在結直腸腫瘤中低表達的原因及其與細胞分化之間的關系，我們利用去甲基化藥物5-aza-dC和促分化藥物丁酸鈉處理結直腸癌細胞株SW480、SW620和RKO。Q-PCR檢測處理前后KLF4 mRNA的表達變化。結果顯示：5-aza-dC處理SW480、SW620及RKO后，KLF4的表達

15、分別升高1.14、5.49及2.10倍。丁酸鈉處理后，KLF4在SW480、SW620及RKO細胞系中的表達分別升高1.39、1.57及1.47倍。其中5-aza-dC處理顯著上調了SW620細胞株KLF4基因的表達(p<0.01)。 通過上述研究，我們得出以下結論： (1)我們成功建立了從EST測序峰圖到候選基因的核酸序列自動化分析平臺。利用該平臺結合在線WebGestalt分析，有助于從整體水平揭示結直腸腺瘤的分子特

16、征，發(fā)現(xiàn)結直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期分子事件，尋找用于早期診斷、治療及預后的分子標志物。 (2)PERP基因在結直腸腫瘤中高表達，其在結直腸癌中的高表達可能與p53基因的突變有關。PERP能促進結直腸癌LoVo，RKO細胞株的增殖和遷移能力。 (3)KLF4基因與結直腸黏膜終末分化相關。其在結直腸腫瘤中的低表達可能與其基因高甲基化狀態(tài)有關。KLF4低表達是結直腸癌淋巴結轉移病人預后不良的潛在指標。 (4)抑制性差減雜