1、目前普遍認為，腎間質(zhì)炎癥和纖維化與腎臟病進展的關(guān)系更加密切，腎小管上皮細胞是介導(dǎo)腎間質(zhì)炎癥和纖維化主要的效應(yīng)細胞。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）被認為是致腎間質(zhì)損傷最重要的細胞因子之一，其致纖維化作用及其下游因子和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已有較多研究，但其在腎間質(zhì)病變中如何積極參與腎間質(zhì)炎癥發(fā)展的研究報道尚不多。近年來，研究者認識到趨化因子在腎間質(zhì)損傷中的重要性，它們主要介導(dǎo)腎臟炎癥發(fā)生和進展階段炎癥細胞的招募和激活。過氧化物酶體增殖物激活受

2、體γ（PPARγ）是核轉(zhuǎn)錄因子，激活后通過結(jié)合靶基因啟動子區(qū)的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPRE）調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。其激活后的生物學(xué)效應(yīng)廣泛，包括調(diào)控炎癥反應(yīng)。因此，本課題利用實時熒光定量PCR技術(shù)和ELISA方法研究TGF-β1對腎小管上皮細胞炎癥相關(guān)趨化因子的表達影響，并進一步研究PPARγ活化在該過程中的干預(yù)作用。 第一部分研究結(jié)果顯示TGF-β1能誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）趨化因子單核細胞趨化蛋白-1（MC

3、P-1）、白介素-8（IL-8）、RANTES的表達上調(diào)，且呈劑量和時間依賴效應(yīng)。2 ng/ml TGF-β1作用24h可誘導(dǎo)MCP-1和IL-8 mRNA明顯升高，5ng/ml TGF-β1作用時達高峰。TGF-β1作用后細胞MCP-1蛋白分泌升高晚于mRNA的變化，24h明顯升高，36h達高峰，48h仍維持在較高水平。IL-8蛋白分泌升高同樣遲于mRNA的表達，24h達高峰并持續(xù)至48h未見明顯下降。TGF-β1可誘導(dǎo)RANTES

4、mRNA明顯升高，RNATES mRNA表達2h時明顯升高，24h達高峰，此后至48h時仍維持在較高水平。RNATES蛋白基礎(chǔ)分泌水平極低，TGF-β1作用HK-2細胞24h時RNATES蛋白分泌開始升高，36小時達到高峰，至48h仍維持在高水平。上述結(jié)果表明，TGF-β1誘導(dǎo)能明顯上調(diào)趨化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表達和蛋白分泌。因此，有效干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的趨化因子的表達可能為減輕腎間質(zhì)炎癥的途徑之一。

5、 本研究第二部分觀察PPARγ天然激動劑15d-PGJ2和合成激動劑曲格列酮（TGL）對TGF-β1誘導(dǎo)的趨化因子MCP-1和IL-8表達的干預(yù)作用。首先通過LDH毒性試驗選擇15d-PGJ2和TGL的作用最高濃度。研究選擇0、0.5、1、2.5、5mM 15d-PGJ2和0、0.5、1、2.5mM TGL作為干預(yù)濃度，預(yù)處理2h，加入5ng/mlTGF-β1分別作用12h或24h收獲細胞和上清液。結(jié)果顯示，5mM 15d-PGJ2和

6、2.5mM TGL不影響HK-2細胞MCP-1和IL-8 mRNA基礎(chǔ)表達和蛋白分泌。TGF-β1作用12h和24h時，2.5mM和5mM 15d-PGJ2及2.5mM TGL均能有效干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的MCP-1 mRNA表達和蛋白的分泌（p＜0.05）。IL-8的表達與MCP-1相似，2.5mM和5mM 15d-PGJ2能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的IL-8 mRNA表達，但TGL干預(yù)作用在TGF-β1誘導(dǎo)12h時不明顯，TGF-β

7、1誘導(dǎo)24h時2.5mM TGL能顯著抑制IL-8 mRNA表達（p＜0.05），而5mM 15d-PGJ2和2.5mM TGL均能顯著下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的IL-8蛋白分泌（p＜0.05）。上述結(jié)果表明，PPARγ激動劑15d-PGJ2和TGL作用，即PPARγ的活化均能有效干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞趨化因子MCP-1和IL-8的表達，具有有效干預(yù)腎間質(zhì)炎癥作用。 為明確PPARγ激動劑的干預(yù)作用是否通過依賴PPAR

8、γ方式的干預(yù)機制，我們構(gòu)建了pcDNA3.1/Zeocin-PPARγ1重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染HK-2細胞，通過鑒定，成功獲得高表達PPARγ1的單克隆細胞株（HK-2/PPARγ1細胞）。研究發(fā)現(xiàn)HK-2/ PPARγ1細胞在TGF-β1誘導(dǎo)下IL-8 mRNA和蛋白分泌與未處理組比較無顯著上調(diào)，MCP-1 mRNA和蛋白分泌與未處理組比較僅輕度上調(diào)，提示HK-2/PPARγ1細胞可通過高表達PPARγ1有效地抑制TGF-β1對趨化因子的