1、背景與目的:
　　目前,在包括我國在內(nèi)的多數(shù)國家和地區(qū),肺癌已占男性各種癌癥發(fā)病率的首位。近年來分子靶向治療作為治療腫瘤的新方法,以其針對性強,不良反應(yīng)小,療效肯定被廣泛關(guān)注,臨床應(yīng)用越來越多。然而分子靶向藥物因其容易產(chǎn)生耐藥而致其療效維持時間短,中位疾病進展時間為6~8個月。因此,研究分子靶向藥物的耐藥機制,探討增強此類藥物敏感性的方法,已成為亟待解決的問題。自噬(Autophagy)是指在細胞營養(yǎng)不良時分解較不重要的細胞結(jié)構(gòu)來

2、提供養(yǎng)份,以滿足細胞代謝需要并維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的現(xiàn)象。已有文獻表明,腫瘤細胞可通過提高自噬水平而抵抗放化療打擊。因此,自噬也可能在腫瘤細胞靶向藥物耐藥機制中發(fā)揮作用。本研究擬探討自噬在A549肺腺癌細胞耐厄洛替尼中的作用。
　　材料和方法:
　　1.細胞培養(yǎng):人肺腺癌A549細胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,A549/ER細胞培養(yǎng)于厄洛替尼終濃度為25μM的RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),兩

3、種細胞均置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞為實驗對象。
　　2.MTT實驗:A549細胞及A549/ER細胞以5x103/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后加厄洛替尼0.01μM、0.1μM、1.0μM、10μM和100μM,同時設(shè)對照組(0.1%DMSO)和空白組,每組5個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后,每孔加入濃度5mg/mlMTT的溶液20μL,孵育4h后,棄上清,加入150μLDMSO,置搖床低速振蕩1

4、0min,用酶標儀檢測求出570nm處的OD值。根據(jù)公式求出相應(yīng)的細胞生長抑制率,求得IC50值。
　　3.細胞免疫熒光測定MAP1-LC3-Ⅱ:A549細胞及A549/ER細胞以1x105/孔接種于24孔板,培養(yǎng)24h細胞貼壁后,分別加入含5μM、25μM厄洛替尼的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h,同時設(shè)對照組(0.1%DMSO),每組3個復(fù)孔。6h后4%多聚甲醛固定15min,含0.1%的Triton-X100的洗滌液于搖床上洗滌3次,每次

5、3-5分鐘,含5%BSA的封閉液封閉60分鐘,500μL稀釋的兔抗人Anti-LC3B(1:100),4℃作用過夜,洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘,1ml稀釋的抗兔FITC(1:1000),室溫下置于搖床避光孵育60分鐘,洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘(避光操作),DAPI染核5min后置于熒光倒置相差顯微鏡下觀察。
　　4.WesternBlot檢測MAP1-LC3-Ⅱ的表達:按5x104/孔接種A549細胞及A549/ER細胞

6、于六孔板中,培養(yǎng)24h后加入厄洛替尼1μM、5μM、25μM,同時設(shè)對照組(0.1%DMSO),分別于加藥后3h、6h、9h、12h后提取蛋白,調(diào)整蛋白濃度后變性,12%SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉6h,一抗[Anti-LC3B(1:1000);GAPDH(1:1000)]4℃作用過夜,TBST洗膜,ECL發(fā)光劑顯影,重復(fù)3次實驗后用QuantityOne軟件ChemiDOCXRS成像系統(tǒng)采集圖像,計算各組LC3-Ⅱ

7、/GAPDH灰度比值。
　　5.流式細胞儀檢測細胞周期與細胞凋亡率:A549/ER細胞按1x106/瓶接種于4瓶75ml的培養(yǎng)瓶內(nèi),培養(yǎng)24h后分別予以以下處理:①0.1%DMSO;②3-MA5mM處理2h;③厄洛替尼100μM;④3-MA5mM預(yù)處理2h后加入厄洛替尼100μM。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集細胞加入70%預(yù)冷乙醇1ml,混勻4℃固定12h,離心去上清,PBS洗兩次,加入碘化丙啶(

8、propidiumiodide,PI)染液1ml,37℃水浴箱靜置30min,用流式細胞儀檢測細胞周期與細胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.在相同濃度厄洛替尼作用下,A549/ER細胞株較A549細胞株抑制率降低,說明本實驗室成功地誘導(dǎo)出人肺腺癌耐厄洛替尼細胞株A549/ER。
　　2.厄洛替尼作用癌A549細胞株及A549/ER細胞株后,具有特征的綠色熒光的MAP1-LC3-Ⅱ蛋白的表達較未予藥物處理的細胞明顯增多,說

9、明厄洛替尼可誘導(dǎo)A549及A549/ER細胞自噬產(chǎn)生。
　　3.低濃度(1、5μmol/L)厄洛替尼作用下,A549細胞及A549/ER細胞LC3-Ⅱ表達較對照組均升高;而高濃度(25μmol/L)厄洛替尼作用下,A549細胞LC3-Ⅱ表達較低濃度時降低,A549/ER細胞LC3-Ⅱ表達仍較低濃度時升高。
　　4.5mM自噬抑制劑3-MA抑制A549/ER細胞的自噬能力后,細胞的凋亡率從7.76%升高至18.85%,可見抑制