1、溫度是影響植物生長(zhǎng)和分布的重要因素。周期性寒害往往引起柑橘果實(shí)產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，甚至樹(shù)體死亡，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，全球的柑橘凍害問(wèn)題仍然沒(méi)有得到有效解決。因此培育柑橘的抗寒品種成為柑橘業(yè)中一個(gè)急需解決的問(wèn)題。隨著植物分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因已成為農(nóng)作物育種新的技術(shù)，植物的抗寒性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，是低溫下多基因共同協(xié)作的結(jié)果。若采用單一的抗寒基因轉(zhuǎn)化植物，雖然能一定程度上提高轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性，但實(shí)際效果并不理想。CBF

2、是一種調(diào)控一系列植物冷馴化相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在低溫下迅速合成，與相應(yīng)順式作用元件CRT/DRE結(jié)合，誘導(dǎo)冷相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而合成糖類、脯氨酸和膜穩(wěn)定蛋白等物質(zhì)，提高植物的抗寒性。因此，利用CBF轉(zhuǎn)化柑橘有望成為培育柑橘抗寒新品種的有效途徑。
　　 枳由于具有抗性強(qiáng)、樹(shù)形矮小等特點(diǎn)，是柑橘的常用砧木。枳也是柑橘中抗寒性最強(qiáng)的品種，可以耐-20℃。所以研究柑橘的抗寒基因首先研究枳的抗寒基因。
　　 為了更好地利用所分

3、離得到的枳CBF基因來(lái)提高柑橘的抗寒性，了解其功能特征與表達(dá)模式是必要的。研究基因的表達(dá)，必須選擇合適的啟動(dòng)子。已有研究報(bào)道了枳CBF基因及其自身啟動(dòng)子的序列，本研究參考此報(bào)道克隆了枳CBF，在其自身啟動(dòng)子的啟動(dòng)下與報(bào)告基因GFP構(gòu)建成融合基因，并構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入到煙草及枳中，觀察枳CBF的時(shí)空表達(dá)模式。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 ①構(gòu)建融合基因CG。以枳DNA為模板，將枳CBF及其自身啟動(dòng)子作為一個(gè)完整的

4、序列克隆出來(lái)，擴(kuò)增產(chǎn)物5'端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，3'端引入SalI酶切位點(diǎn)。以PMV質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增GFP，在5'端引入SalI酶切位點(diǎn)，在3'端增加BstpⅠ酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增的CBF與GFP序列分別用SalI進(jìn)行單酶切、連接。在此過(guò)程中注意融合基因移碼問(wèn)題，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為目的融合基因，命名為CG。全長(zhǎng)為2.4 kb，是一個(gè)由枳CBF基因自身啟動(dòng)子、枳CBF與GFP構(gòu)成的融合基因。
　　 ②構(gòu)建融合基因表達(dá)載體CG23

5、01。以表達(dá)載體pCAMBIA2301為基礎(chǔ)載體，用EcoRI、Bstp分別雙酶切pCAMBIA2301與融合基因CG后，T4 ligase連接，構(gòu)建成融合基因表達(dá)載體CG2301。此載體含枳CBF與GFP的融合基因CG，并由枳CBF自身啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，為Kan抗性。
　　 ③融合基因表達(dá)載體CG2301在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了43棵生根的抗性苗，經(jīng)PCR鑒定，獲得13株轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 ④融合基因表達(dá)

6、載體CG2301在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下采用上胚軸轉(zhuǎn)化枳，取其中的14株抗性芽進(jìn)行PCR鑒定，獲得2株轉(zhuǎn)基因枳。
　　 ⑤研究融合基因CG在煙草中的表達(dá)模式。將轉(zhuǎn)基因煙草在4℃與-5℃溫度處理不同的時(shí)間后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察基因在不同的器官中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，熒光首先在根系表達(dá)(在4℃下2h、-5℃下15min即可檢測(cè)到)，其次是在葉片(4℃下12h、-5℃下15min有少量熒光)，莖中的表達(dá)最晚(4℃下48 h、-5℃下30 min