1、溫度是影響植物生長和分布的重要因素。周期性寒害往往引起柑橘果實產量降低、品質下降，甚至樹體死亡，從而造成巨大的經濟損失。迄今為止，全球的柑橘凍害問題仍然沒有得到有效解決。因此培育柑橘的抗寒品種成為柑橘業(yè)中一個急需解決的問題。隨著植物分子生物學的發(fā)展，轉基因已成為農作物育種新的技術，植物的抗寒性狀是復雜的數量性狀，是低溫下多基因共同協(xié)作的結果。若采用單一的抗寒基因轉化植物，雖然能一定程度上提高轉基因植物的抗寒性，但實際效果并不理想。CBF

2、是一種調控一系列植物冷馴化相關基因表達的轉錄因子，在低溫下迅速合成，與相應順式作用元件CRT/DRE結合，誘導冷相關基因的表達，進而合成糖類、脯氨酸和膜穩(wěn)定蛋白等物質，提高植物的抗寒性。因此，利用CBF轉化柑橘有望成為培育柑橘抗寒新品種的有效途徑。
　　 枳由于具有抗性強、樹形矮小等特點，是柑橘的常用砧木。枳也是柑橘中抗寒性最強的品種，可以耐-20℃。所以研究柑橘的抗寒基因首先研究枳的抗寒基因。
　　 為了更好地利用所分

3、離得到的枳CBF基因來提高柑橘的抗寒性，了解其功能特征與表達模式是必要的。研究基因的表達，必須選擇合適的啟動子。已有研究報道了枳CBF基因及其自身啟動子的序列，本研究參考此報道克隆了枳CBF，在其自身啟動子的啟動下與報告基因GFP構建成融合基因，并構建融合基因表達載體，在農桿菌介導下轉入到煙草及枳中，觀察枳CBF的時空表達模式。主要試驗結果如下：
　　 ①構建融合基因CG。以枳DNA為模板，將枳CBF及其自身啟動子作為一個完整的

4、序列克隆出來，擴增產物5'端引入EcoRI酶切位點，3'端引入SalI酶切位點。以PMV質粒為模板，擴增GFP，在5'端引入SalI酶切位點，在3'端增加BstpⅠ酶切位點。將擴增的CBF與GFP序列分別用SalI進行單酶切、連接。在此過程中注意融合基因移碼問題，擴增產物經測序驗證為目的融合基因，命名為CG。全長為2.4 kb，是一個由枳CBF基因自身啟動子、枳CBF與GFP構成的融合基因。
　　 ②構建融合基因表達載體CG23

5、01。以表達載體pCAMBIA2301為基礎載體，用EcoRI、Bstp分別雙酶切pCAMBIA2301與融合基因CG后，T4 ligase連接，構建成融合基因表達載體CG2301。此載體含枳CBF與GFP的融合基因CG，并由枳CBF自身啟動子啟動表達，為Kan抗性。
　　 ③融合基因表達載體CG2301在農桿菌介導下采用葉盤法轉化煙草，獲得了43棵生根的抗性苗，經PCR鑒定，獲得13株轉基因煙草。
　　 ④融合基因表達

6、載體CG2301在農桿菌介導下采用上胚軸轉化枳，取其中的14株抗性芽進行PCR鑒定，獲得2株轉基因枳。
　　 ⑤研究融合基因CG在煙草中的表達模式。將轉基因煙草在4℃與-5℃溫度處理不同的時間后，通過熒光顯微鏡觀察基因在不同的器官中的表達情況。結果表明，熒光首先在根系表達(在4℃下2h、-5℃下15min即可檢測到)，其次是在葉片(4℃下12h、-5℃下15min有少量熒光)，莖中的表達最晚(4℃下48 h、-5℃下30 min