1、背景： 多種原因所致的關(guān)節(jié)軟骨缺損在醫(yī)學臨床較為常見，目前所用的保守治療和手術(shù)治療方法均存在明顯缺陷。關(guān)節(jié)軟骨組織工程技術(shù)可為其再生修復提供新的治療手段。近年來骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，因具有良好的體外擴增能力、且具有軟骨分化潛能，已成為體外構(gòu)建組織工程軟骨的重要種子細胞來源，許多實驗表明移植入宿主體內(nèi)的BMSCs能促進宿主體內(nèi)缺損功能的修復，展示了光明的前景。然而目前困擾關(guān)節(jié)組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用的一個重要難題--對體內(nèi)原

2、位種子細胞的研究缺乏有效的識別和追蹤監(jiān)測手段，因而難以明確外源性種子細胞在軟骨缺損修復中的作用和轉(zhuǎn)歸，體內(nèi)新生軟骨組織的細胞來源，細胞移植術(shù)的療效。因此迫切需要探索一種對體內(nèi)原位移植細胞進行追蹤和監(jiān)測的安全、有效、無創(chuàng)的手段，以促進組織工程軟骨修復關(guān)節(jié)軟骨缺損技術(shù)研究的進一步深入。 目的： 本項目擬在課題組既往關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究獲得重要進展的基礎(chǔ)上，借鑒國內(nèi)外最新研究成果，研究體外SPIO標記種子細胞BMSCs的適宜方

3、法、磁標記物對種子細胞生物學特性的影響、MRI監(jiān)測體外磁標記細胞的靈敏度、準確度及MRI活體示蹤自體皮下移植磁化標記BMSCs的可行性，最后通過不同時相點1.5TMRI在體示蹤種子細胞在活體內(nèi)的存活、遷徙及分布，以及結(jié)合BrdU細胞示蹤技術(shù)作為陽性對照，并判定其磁標記細胞的分化轉(zhuǎn)歸過程，完成其自體移植修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的動物實驗應(yīng)用研究，為關(guān)節(jié)軟骨組織工程種子細胞的在體示蹤提供一種安全無創(chuàng)、動態(tài)直觀的新技術(shù)和新方法。 方法：

4、 l、體外納米磁標記BMSCs的體外細胞生物學特性及其MR成像 從兔骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，不同濃度SPIO(50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml)聯(lián)合硫酸魚精蛋白轉(zhuǎn)染劑與BMSCs孵育12h，未標記細胞設(shè)為對照組。普魯士染色和電鏡檢查鑒定細胞內(nèi)是否含鐵顆粒；胎盼藍染色檢測細胞存活和.MTT法測定生長曲線的變化；磁標記BMSCs轉(zhuǎn)入各定向培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)2w后；鑒定磁標記BMSCs的多向分化潛能：對成骨定向

5、誘導組進行鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色和堿性磷酸酶(ALP)組化染色，對成脂肪定向誘導組觀察細胞形態(tài)學變化或油紅-O染色，對成軟骨定向誘導組進行番紅-0染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測胞外基質(zhì)的分泌和表達；應(yīng)用1.5TMR梯度回波T2加權(quán)(GRET2﹡WI)掃描序列和自旋回波T2加權(quán)(SET2WI)掃描序列對磁標記細胞成像示蹤。 2、MR成像示蹤磁標記免BMSCs自體皮下移植 BMSCs經(jīng)體外采用SPIO和BrdU雙重標記后，與殼聚糖

6、-甘油磷酸鈉(C-GP)支架復合植入兔自體大腿皮下，在術(shù)后1h、第5d及2w、4w、8w應(yīng)用0.2TMRORET2﹡WI序列對磁標記細胞成像行連續(xù)示蹤，掃描后即處死動物并取材行組織切片普魯士染色及免疫組化BrdU檢查。實驗組為自體皮下移植SPIO標記BMSCs(n=6)，設(shè)立自體皮下移植未標記。BMSCs(n=6)和皮下單純注射SPIO組(n=2)為兩組對照。 3、MR在體成像示蹤磁標記的BMSCs修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損 建

7、立兔膝直徑4mm深約3mm的股骨髁軟骨缺損模型，1周后將經(jīng)SPIO和BrdU雙重標記的BMSCs與C-GP支架1ml復合，然后注射到自體軟骨損傷關(guān)節(jié)腔中，術(shù)后1h、4w、8w及12w應(yīng)用1.5TMRGRET2﹡WI序列對膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入的磁標記BMSCs進行掃描示蹤，并與組織切片普魯士染色及免疫組化BrdU對照。實驗組為損傷側(cè)膝關(guān)節(jié)注入1ml含1×108個磁標記BMSCs與C-GP支架混懸液；設(shè)立注入1ml含1×108個未標記BMSCs與

8、C-GP支架混懸液、損傷側(cè)膝關(guān)節(jié)不做任何處理為兩組對照(n=6)。 結(jié)果： 1、體外納米磁標記BMSCs細胞生物學特性及其MR成像 磁標記細胞普魯士染色和電鏡檢查顯示細胞胞漿內(nèi)含致密鐵顆粒；胎盼藍染色和MTT分析測定生長曲線證實磁標記對BMSCs活性和增殖無影響(P＞0.05)；納米磁標記BMSCs在體外具有向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞表型誘到的潛能。1.5TMR掃描GRET2*WI序列和SET2WI序列提示與

9、未標記細胞SI相比，1×1O6個標記細胞、5x105個標記細胞信號強度均有不同程度顯著性下降(P＜0.05)其中GRET2*WI的信號強度衰減率顯著性高于T2WI序列(P＜0.05)。在兩個序列中1×106(標記細胞)信號強度衰減率均高于5x105(標記細胞)信號強度衰減率，但不具有有顯著性差異。 2、MR成像示蹤磁標記兔BMSCs自體皮下移植 自體皮下移植的磁標記兔BMSCs在GRET2﹡WI序列成像時產(chǎn)生特征性的低信

10、號改變至少維持8周。術(shù)后1h兔后肢0.2TMRGRET2*WI序列成像示磁標記細胞在皮下注入部位形成直徑約1.5cm的特異性類圓形低信號影。術(shù)后5d觀察到距注射部位后側(cè)0.5cm處皮下出現(xiàn)孤立的特異性低信號影，原皮下注射部位特異性低信號影直徑擴大至1.7cm，低信號強度未見減弱。術(shù)后2w見皮下孤立的特異性低信號影已與原皮下注射部位特異性低信號影融合，并呈線性延伸為0.6cm，低信號區(qū)域直徑擴大為2.0cm，侵及肌層。術(shù)后4w見低信號區(qū)域

11、進一步擴大。術(shù)后8w見皮下注射部位向周圍發(fā)出的低信號線顯著長達1.1cm，低信號區(qū)域直徑擴大為2.6cm，侵及肌肉深層，低信號強度減弱。MRI信號改變區(qū)域與組織學切片普魯士染色及免疫組化BrdU顯示植入細胞結(jié)果相對應(yīng)。術(shù)后第5d移植部位見植入細胞密集，植入物與宿主組織界面周圍散在出現(xiàn)植入細胞。術(shù)后2w至4w見移植部位與宿主組織界面周圍出現(xiàn)的植入細胞較前增加，但植入細胞主要聚集在移植部位內(nèi)，術(shù)后8w移植部位植入細胞減少，宿主組織內(nèi)出現(xiàn)的植

12、入細胞較前顯著增加。HE染色觀察到術(shù)后初期在植入?yún)^(qū)域出現(xiàn)炎性反應(yīng)，但術(shù)后1周炎性反應(yīng)消失，所有動物的移植部位均未出現(xiàn)切口紅腫和分泌物。 3、MR在體成像示蹤磁標記的BMSCs修復免關(guān)節(jié)軟骨缺損 體外磁標記的BMSCs與C-GP復合注射入關(guān)節(jié)腔后1.5TMRGRET2﹡WI序列成像顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)磁標記BMSCs產(chǎn)生彌漫性顆粒狀低信號影改變至少12w，術(shù)后1h可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)彌漫性顆粒狀異常低信號改變，主要分布于和胭窩部位，術(shù)

13、后4w觀察到軟骨缺損部位、軟骨下骨處特異性低信號影改變。但隨著移植時間延長，低信號強度逐漸減弱，術(shù)后12w軟骨缺損處特異性低信號影不明顯，而關(guān)節(jié)腔內(nèi)髕上囊、胭窩處結(jié)節(jié)狀低信號改變?nèi)郧逦嬖凇RI信號改變區(qū)域與組織學切片普魯士染色及免疫組化BrdU顯示植入細胞結(jié)果相對應(yīng)。術(shù)后4w見軟骨修復區(qū)有少量植入細胞存在，大量植入細胞主要分布于髕上囊、胭窩處滑膜和軟骨下骨，術(shù)后8w軟骨修復區(qū)植入細胞消失，滑膜中植入細胞數(shù)目亦減少，術(shù)后12w軟骨修復

14、區(qū)亦未見植入細胞，而髕上囊滑膜和軟骨下骨部位仍較多存在植入細胞。 結(jié)論： 1、SPIO聯(lián)合硫酸魚精蛋白轉(zhuǎn)染劑能成功標記BMSCs，磁標記對細胞存活、增殖及潛在多向分化能力無影響，磁標記細胞在MR上產(chǎn)生特征性的低信號改變，臨床1.5TMR成像示蹤標記細胞可行，以GRET2﹡WI序列成像最為敏感。 2、自體皮下移植的磁標記兔BMSCs在0.2TGRET2﹡WI序列產(chǎn)生特征性的低信號改變至少8w，術(shù)后1h、第5d、2w

15、、4w、8w不同時相MR連續(xù)成像觀察到植入細胞從皮下移植部位向遠處遷移并逐漸進入宿主組織。術(shù)后2w、4w、8w時植入細胞的組織學改變與MRI結(jié)果基本一致。移植的磁標記細胞在具有免疫功能的皮下未誘發(fā)明顯的免疫反應(yīng)。利用0.2TMR連續(xù)示蹤自體皮下移植的磁標記BMSCs活體內(nèi)的分布和遷移是可行的。 3、兔BMSCs經(jīng)SPIO標記后仍然具有成軟骨細胞誘導能力；磁標記后植入關(guān)節(jié)腔內(nèi)的BMSCs可以在臨床1.5TMR上產(chǎn)生明顯的低信號改變

16、至少12w，術(shù)后1h、4w、8w、12w時不同時相MR連續(xù)成像觀察到關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分植入細胞向軟骨缺損遷移聚集隨后又逐漸減少，至術(shù)后12w時軟骨缺損部位植入細胞消失，此時植入細胞主要分布于關(guān)節(jié)腔內(nèi)髕上囊、胭窩、軟骨下骨。術(shù)后4w、8w、12w時植入細胞的組織學改變與MRI結(jié)果基本一致，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入體外擴增培養(yǎng)的磁標記BMSCs，不能促進軟骨缺損修復。應(yīng)用MRI在體示蹤磁標記細胞技術(shù)可以連續(xù)示蹤組織工程軟骨種子細胞BMSCs在活體關(guān)節(jié)腔內(nèi)的分