硒結(jié)合蛋白1(SBP1)抑制肝細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全球常見惡性腫瘤中居第六位,在腫瘤相關性死亡中居第三位。雖然目前在肝癌的早期診斷、手術切除及肝臟移植方面取得了諸多進步,肝癌患者的生存率得到很大的提高,但是仍然只有30%~40%的患者適宜行根治性手術。而且即使是根治性切除,5年內(nèi)仍有60%~70%的患者出現(xiàn)復發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此,探索肝癌發(fā)生發(fā)展及復發(fā)轉(zhuǎn)移的機制,尋找有效的抑制途徑與方法,已成為提高肝癌生存率的關鍵。

2、>  硒(Selenium)是一種重要的微量元素,它對腫瘤的預防與抑制作用已經(jīng)被很多研究所證實。含硒蛋白(selenium containing proteins)是硒元素在體內(nèi)的存在形式,不同的含硒蛋白有著截然不同的物化特性與生理功能。其中,硒結(jié)合蛋白1(Selenium-binding protein1,SBP1)被認為是硒元素抑癌作用的重要載體。研究已經(jīng)表明許多腫瘤組織中的SBP1表達水平低于正常組織,并且與腫瘤的不良預后密切相關

3、。但是SBP1在原發(fā)性肝癌發(fā)展預后中的作用尚無相關研究,其抑癌作用的可能機制也鮮有提及。
  谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase1,GPX1)是另一種重要的含硒蛋白,它的抗氧化作用可以保護細胞免受氧自由基的損害,大量的研究表明它對腫瘤細胞也有著相同的保護作用。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SBP1與GPX1之間可能存在一定的相互作用,但是并未深入探討其在腫瘤發(fā)展過程中所起到的作用。另一方面,SBP1的表達受到缺

4、氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,H1F-1α)的調(diào)控,HIF-1α是細胞面對缺氧、氧應激時重要的應答因子,它在腫瘤的進展過程中有著復雜的生物學功能。GPX1、HIF-1α與SBP1之間的相互聯(lián)系是否與其抑癌作用相關,值得我們的研究。
  本研究中,我們通過比較不同惡性程度及侵襲能力的人肝癌細胞系中SBP1表達的情況,利用siRNA技術研究SBP1在肝癌細胞侵襲、遷移、增殖及凋亡過程中的作用

5、,進一步探討了SBP1抑癌作用的可能分子機制,并通過臨床標本加以證實。最后,通過組織芯片技術,在大規(guī)模樣本群中研究SBP1在肝癌組織中的表達情況及其與臨床預后的關系,探討其對臨床實踐的意義與作用。
  第一部分SBP1在人肝癌細胞系中的表達情況及其對肝癌細胞的抑制作用
  本部分旨在研究SBP1在人正常肝細胞系和肝癌細胞系的表達情況,并通過一系列體外實驗證實SBP1對肝癌細胞的抑制作用。選用正常肝細胞系L-02和Hep3B、

6、HepG2、Huh7、SMMC7721、PLC/PRF/5、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6共9種不同的人肝癌細胞系,通過Western blot方法檢測上述細胞系中SBP1的表達情況;從中選取SBP1高表達的肝癌細胞株SMMC7721,利用siRNA方法建立敲低組與對照組,并利用Real-time PCR、Western blot、免疫熒光等方法加以證實;通過一系列體外實驗研究SBP1敲低組與對照組之間不

7、同的生物學特性。
  結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBP1在正常肝細胞系中高表達,而在肝癌細胞系中,除SMMC7721外,均表現(xiàn)為低表達,尤其在高轉(zhuǎn)移潛能的細胞系中幾乎不表達。進一步的體外實驗表明SBP1可以抑制腫瘤細胞的遷移,但是僅在過氧化氫處理的情況下表現(xiàn)出對腫瘤細胞增殖的抑制作用和對其凋亡的促進作用。
  研究表明,正常肝細胞高表達SBP1而大部分肝癌細胞系普遍低表達。減少SBP1的表達可以促進腫瘤細胞的遷移,同時幫助腫瘤細胞在過氧化氫處

8、理的情況下保持增殖能力并且逃避凋亡。而在正常情況下SBP1并不表現(xiàn)出這樣的作用,說明其抑癌作用可能與其對活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)的調(diào)節(jié)有關。
  第二部分SBP1抑制肝癌細胞增殖、促進其凋亡的機制以及SBP1、GPX1與HIF-1α之間的相互作用
  本部分旨在探討SBP1在特定條件下抑制腫瘤增殖、促進其凋亡的機制并建立起SBP1、GPX1與HIF-1α之間的相互作用關系。我們通

9、過Western blot方法檢測正常條件下與過氧化氫處理下各組別SMMC7721細胞中SBP1、GPX1、HIF-1α的表達水平;利用酶活性試劑盒測定不同組別不同處理條件下GPX1的活性;利用免疫熒光雙染技術研究SBP1與GPX1在各種處理條件下的相互作用。
  結(jié)果顯示,過氧化氫的處理可以上調(diào)對照組細胞中HIF-1α與SBP1的表達,而在SBP1敲低組,同樣的處理卻并不能上調(diào)細胞中HIF-1α的表達;GPX1的表達量在各組別之

10、間無明顯差別,但是其活性在SBP1敲低組中顯著高于對照組(P<0.001);免疫熒光提示在過氧化氫處理條件下,SBP1與GPX1均可以形成特殊的核小體(nuclear body),并且共定位于核中。
  研究結(jié)果表明,活性氧自由基能夠上調(diào)HIF-1α的表達,同時也會上調(diào)作為HIF-1α靶基因的SBP1的表達,而利用siRNA敲除SBP1的表達也會逆向抑制HIF-1α的表達;另一方面,SBP1雖不能影響GPX1的表達量,但是能夠通過

11、兩者之間的相互作用顯著抑制GPX1的活性。SBP1的抑癌作用可能是通過它對GPX1活性的抑制、對HIF-1α表達量的上調(diào),從而調(diào)節(jié)腫瘤氧化還原微環(huán)境(tumor redoxmicroenvironment)而實現(xiàn)的。
  第三部分SBP1在肝癌組織中的表達及其臨床意義研究
  本部分旨在探討SBP1在肝細胞癌患者腫瘤組織中的表達情況以及進一步證實其在體內(nèi)對GPX1活性的抑制作用,同時分析SBP1的表達高低與肝細胞肝癌臨床病理

12、特征和預后的關系。
  選用新鮮切除的肝癌標本19例,其中無血管侵犯9例,有血管侵犯10例,應用Western blot技術驗證其中SBP1蛋白表達情況,比較兩組間SBP1蛋白水平的表達差異,同時測定各樣本GPX1的活性。在323例肝細胞癌組織構(gòu)建的組織芯片中應用免疫組化方法檢測SBP1蛋白的表達,比較分析肝癌組織中SBP1表達與臨床病理特征以及生存、復發(fā)的關系,分析比較肝癌組織中SBP1表達與術后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的相關性,評估SBP

13、1作為肝癌預后判斷指標的價值。
  結(jié)果發(fā)現(xiàn),無血管侵犯的標本中,SBP1的表達量要顯著高于有血管侵犯的組別(P<0.05),同時標本中GPX1的活性與SBP1的表達呈負相關。組織芯片結(jié)果顯示,肝癌組織中SBP1蛋白的表達水平與年齡、術前AFP、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、腫瘤包膜、血管侵犯、腫瘤復發(fā)有關(P<0.05)。多因素分析顯示,性別、血清ALB、腫瘤分化程度、腫瘤包膜、腫瘤大小、血管侵犯與SBP1表達水平為影響患者總體生存率(o

14、verall survival,OS)的獨立預后因素;性別、血清ALT、腫瘤包膜、腫瘤大小、血管侵犯與SBP1表達水平為影響患者復發(fā)率的獨立預后因素。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示,SBP1低表達組預后顯著差于SBP1高表達組。在SBP1低表達的病例中,69.08%的患者腫瘤復發(fā),其中早期復發(fā)的病例占到了55.07%;而在SBP1高表達組中,50.86%的患者腫瘤復發(fā),早期復發(fā)的病例僅占28.45%。利用米蘭標準將患者分層后進一

15、步的分析提示,SBP1對于超出米蘭標準病例的預后有更大的預測意義。
  研究結(jié)果表明,SBP1的低表達與肝細胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預后相關。SBP1的表達是肝癌患者預后的獨立預測指標,特別是中晚期的肝癌。
  結(jié)論
  1.SBP1在大多數(shù)人肝癌細胞系中低表達,尤其是轉(zhuǎn)移潛能較高的細胞系中;而在正常肝細胞中高表達。
  2.減少SBP1的表達可以促進腫瘤細胞的遷移,同時幫助腫瘤細胞在受到氧自由基攻擊時保持增殖能力

16、并且逃避凋亡。
  3.SBP1可以抑制GPX1的活性、上調(diào)HIF-1α的表達,從而通過調(diào)節(jié)腫瘤氧化還原微環(huán)境來實現(xiàn)其抑癌作用。
  4.SBP1的低表達與肝細胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預后相關。SBP1的表達是肝癌患者預后的獨立預測指標,特別是在中晚期的肝癌患者中。
  創(chuàng)新點
  1.SBP1的促氧化作用可能是其抑制腫瘤的重要機制。
  2.首次發(fā)現(xiàn)并報道SBP1與肝癌預后密切相關。肝癌組織中SBP1的表達

溫馨提示

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