1、干細胞是指能夠相對無限或較長時間自我更新的細胞，并且新復制的細胞可以分化成一種以上的功能細胞系。而神經干細胞(neuralstemcell，NSC)則是指能夠自我復制和具有神經定向分化能力的細胞。自然的NSC分裂分化活動受到多種因素的調節(jié)，主要分為內因和外因兩方面。內因主要是影響細胞周期和各種細胞周期因子，諸如Notch信號、Math基因家族、gp130/JAK/stat3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號途徑等，外因受細胞因子和微環(huán)境的影響。目前，

2、對NSC分化研究側重于細胞因子及內環(huán)境信號的作用。不同種類的細胞因子、同一細胞因子不同濃度以及多種細胞因子聯(lián)合應用對NSC誘導分化作用各不相同，且不同階段，相同細胞因子的作用亦不同。 研究表明鈣通道在神經發(fā)育過程中具有重要作用，例如：神經錐生長、神經元的遷移、軸突和樹突的延伸、突觸可塑性等。Gage等在培養(yǎng)的胚胎E16天的海馬前體細胞上記錄到了電壓依賴性鈣電流，并且有報道電壓依賴性鈣通道參與了胚胎海馬神經前體細胞向神經元分化的調

3、控。 近年來，大量的研究表明，TRP通道作為一類新發(fā)現(xiàn)的Ca2+攝入途徑，在調節(jié)胞內Ca2+平衡，傳遞胞外信號方面發(fā)揮重要作用。最近，多個工作證明TRP通道介導了神經元生長錐的轉向。Greka等報道，TRPC5可以調節(jié)海馬神經突起的長度及生長錐的形態(tài)。Bezzerides等報道，在海馬神經元中，神經生長因子等可以誘導TRPC5快速轉運到細胞膜上，并影響神經突起的延伸。2005年，蒲慕明實驗室報道TRP通道的激活，使得鈣離子濃度升

4、高，引起netrin-1和BDNF介導的生長錐的轉向。很顯然，隨著研究的深入，更多的TRP通道在發(fā)育中的重要作用將被揭示出來。 本研究的目的主要是建立并純化胚胎神經干細胞的培養(yǎng)方法，并觀察TRP通道阻斷劑鑭、SKF96365對胚胎神經干細胞增殖和分化的影響，探討TRP通道在調控胚胎神經干細胞分裂分化中的作用。 本實驗分離孕鼠大腦半球，制成單細胞懸液，培養(yǎng)胚胎神經干細胞，利用無血清培養(yǎng)技術，在添加堿性成纖維細胞生長因子(b

5、FGF)、表皮生長因子(EGF)、B27supplement的DMEM/F12培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，連續(xù)傳代。培養(yǎng)的胚胎神經干細胞，球體透亮，邊緣整齊，細胞排列緊密。在位于球邊緣的細胞膜上，還可見到睫毛狀小突起，隨著培養(yǎng)神經細胞球漸變大。和一般的細胞相比，神經干細胞具有細胞核相對較大，胞漿少的特點。分別取原代和傳代培養(yǎng)的細胞做免疫熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)均有細胞表達巢蛋白(nestin)抗原，傳至第三代細胞nestin陽性率可達99％。我們觀察了3-

6、5代的細胞在細胞形態(tài)及增殖速率上沒有明顯的變化，以下實驗均取用3-5代的細胞。 在細胞培養(yǎng)液中加入5umol/L的BrdU，作用2小時，免疫熒光雙標BrdU與nestin發(fā)現(xiàn)細胞共表達這兩種抗原，說明細胞處于活躍的分裂增殖期。 將干細胞培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基，誘導細胞分化。分化2天后，鏡下觀察細胞長出突起，已初步具有神經元和膠質細胞形態(tài)，細胞免疫熒光分別呈DCX和S-100β陽性。Doublecortin(DCX)是未成熟

7、神經元的標志物，它位于細胞體的周邊部，與微管重疊。S-100β是一種神經膠質細胞分泌的鈣活性蛋白質。細胞克隆球來自神經系統(tǒng)，可分化為神經元、膠質細胞；能自我復制，證實所培養(yǎng)的細胞為神經干細胞。 MTT檢測結果：分別加入不同濃度的TRP通道阻斷劑LaCl3和SKF96365處理細胞。其OD值分別為control組的81.39％、75.56％、61.01％及87.76％、83.95％、74.93％，呈濃度依賴性降低。免疫熒光DAPI

8、染色及流式細胞儀實驗顯示，LaCl3不引起細胞死亡，免疫熒光DAPI染色也證實SKF96365不引起細胞死亡。結果表明LaCl3和SKF96365對神經干細胞的數(shù)量有影響，可降低胚胎神經干細胞的數(shù)量。 細胞免疫熒光檢測結果：把單細胞懸液接種于經PLL包被的培養(yǎng)板上，加入5umol/L的BrdU2小時后，加入不同濃度LaCl3處理30分鐘，通過免疫細胞化學計數(shù)BrdU陽性細胞的數(shù)量。25uMLa組、50uMLa組、100uMLa組

9、，BrdU陽性細胞數(shù)分別為control組的62.99％、59.54％、44.83％，與control組比較有統(tǒng)計學意義?？梢奓aCl3可抑制神經干細胞的增殖，且呈濃度依賴性。 流式細胞儀檢測結果：增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)表示細胞增殖活性，其計算公式為：PI％=(S+G2/M)÷(GO/GI+S+G2/M)×100％。通過計算得出control組其PI為50.40％，LaCl3處理組PI為36.20

10、％。實驗結果進一步表明LaCl3可抑制神經干細胞的增殖。 對細胞分化的影響：把單細胞懸液接種于經PLL包被的培養(yǎng)板上，先加入5umol/L的BrdU2小時后，再加入不同濃度LaCl3，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，對細胞進行免疫標記BrdU和DCX或BrdU和S-100β，分別計數(shù)BrdU、DCX及S-100β陽性細胞的數(shù)量。 LaCl3處理后BrdU陽性細胞數(shù)量減少，DCX或S-100β陽性細胞數(shù)量增加。25uMLa組、5