1、研究背景：
　　 脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重創(chuàng)傷,常導致不可逆的感覺及運動功能喪失和大小便失禁,致殘率高,對病人的生活造成極大的損害,給患者家庭及社會帶來沉重的負擔。脊髓損傷的修復一直是神經(jīng)科學領域中所面臨的一項挑戰(zhàn)性的任務。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復能力很差,脊髓損傷后機體經(jīng)歷原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的過程,造成不同程度的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的壞死、凋亡,軸突的斷裂、脫髓鞘,脊髓損傷后早

2、期的病理變化主要是由于原發(fā)性損傷造成的中央出血性壞死,主要為神經(jīng)細胞、組織的壞死和脊髓的小血管出血,尤其是灰質(zhì)的許多小靜脈有明顯出血；隨之而來的繼發(fā)性損傷對脊髓的影響更大,它的機制涉及損傷部位脊髓缺血缺氧性改變、神經(jīng)組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸(EAA)毒性作用、神經(jīng)細胞內(nèi)離子失衡(鈣超載)、細胞因子及凋亡學說、自由基損傷與脂質(zhì)過氧化反應、一氧化氮/一氧化氮合酶(NO/NOS)神經(jīng)毒性作用等,最終形成壞死囊腔、脊髓組織軟化或形成膠質(zhì)瘢

3、痕,這些繼發(fā)性損傷造成膠質(zhì)細胞的反應性膠質(zhì)化,瘢痕對軸突再生形成障礙,引起脊髓永久性功能喪失。因此如何替代原發(fā)性損傷造成的神經(jīng)細胞缺失和改善繼發(fā)性損傷造成的影響是治療脊髓損傷的一個重要課題。
　　 脊髓損傷的修復包括神經(jīng)元及軸突的再生、神經(jīng)元的整合和突觸的建立,神經(jīng)功能的重建,因此治療SCI要考慮下行的運動和上行的感覺纖維須再生修復,損傷導致的神經(jīng)細胞死亡,包括運動神經(jīng)元和中間神經(jīng)元,須由正常神經(jīng)細胞替代。傳統(tǒng)的藥物及物理治療對

4、脊髓損傷后功能修復效果不佳,而干細胞替代治療是治療脊髓損傷的一個新的方向。干細胞可能通過以下機理在SCI修復中發(fā)揮作用:(1)神經(jīng)替代作用重建神經(jīng)元環(huán)路；(2)提供支持的環(huán)境促進神經(jīng)元軸突的再生；(3)分泌的一些營養(yǎng)因子改善脊髓內(nèi)的微環(huán)境,可以促進部分損傷的神經(jīng)恢復部分功能。
　　 脊髓損傷后不利的微環(huán)境可能對移植入的細胞造成損傷,促使其凋亡,如何更好的改善微環(huán)境,使移植的細胞存活更好是當前研究的一個重要方面。粒細胞集落刺激因子

5、(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)能參與神經(jīng)損傷的代償和保護,減輕神經(jīng)損傷的程度,具有對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復作用。它可以對造血細胞的生長和分化起介導作用,具有刺激骨髓細胞增殖和成熟的生物學功能,是骨髓造血干細胞的動員劑,可動員大量的骨髓基質(zhì)細胞進入外周血循環(huán),并可刺激骨髓基質(zhì)細胞增殖和遷移。另外文獻報道,G-CSF可以明顯增加實驗動物腦損傷周圍區(qū)的nestin蛋白表達,并降低腦缺血和

6、損傷的死亡率,能參與神經(jīng)損傷的代償和保護,減輕神經(jīng)損傷的程度。有學者認為G-CSF除具有造血刺激因子的功能外,還可以誘導內(nèi)皮細胞的遷移和增殖,增加神經(jīng)系統(tǒng)損傷后血管的生成,并促進血液中的骨髓基質(zhì)細胞遷移至損傷部位,分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,并釋放一些神經(jīng)營養(yǎng)因子,可能通過抗凋亡、抗炎癥、促血管生長及促神經(jīng)干細胞分化等多種機制促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復。
　　 因此我們希望通過體外培養(yǎng)擴增獲得大量純化的骨髓基質(zhì)細胞,采用谷氨酸體外誘導模

7、擬脊髓損傷后細胞凋亡的環(huán)境,并通過觀察粒細胞集落刺激因子對谷氨酸處理的骨髓基質(zhì)細胞存活率的影響,了解粒細胞集落刺激因子對谷氨酸誘導的骨髓基質(zhì)細胞凋亡的影響。另外建立穩(wěn)定的大鼠脊髓全橫斷動物模型,采用骨髓基質(zhì)細胞移植聯(lián)合粒細胞集落刺激因子治療,通過觀察動物的運動功能,組織學檢查,細胞的凋亡檢查來判斷聯(lián)合治療對脊髓損傷的療效.
　　 研究目的:
　　 1.探索不同濃度的谷氨酸和大鼠骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)對細胞存活率的影響;

8、>　　 2.探索不同濃度的粒細胞集落刺激因子對谷氨酸和大鼠骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)后細胞存活率的的影響；
　　 3.探索骨髓基質(zhì)細胞移植聯(lián)合粒細胞集落刺激因子對大鼠脊髓全橫斷損傷后神經(jīng)功能恢復的影響。
　　 第一部分 大鼠骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)鑒定及谷氨酸對其存活率的影響
　　 目的：建立大鼠骨髓基質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)和擴增方法,并從細胞形態(tài)、標志性蛋白的表達鑒定所獲得的細胞；采用不同濃度谷氨酸和骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng),了解谷氨

9、酸對大鼠骨髓基質(zhì)細胞存活率的影響。
　　 方法:無菌條件下取大鼠股骨脛骨,應用密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)細胞,體外貼壁培養(yǎng)純化及擴增骨髓基質(zhì)細胞,相差顯微鏡下觀察骨髓基質(zhì)細胞的形態(tài)學特征,免疫組化法檢測骨髓基質(zhì)細胞表面的CD34、CD44、CD29、CD90蛋白表達,熒光顯微鏡下觀察其結(jié)果；采用流式細胞儀檢測其表面CD34、CD44、CD29、CD90的表達；實驗分組:A組為對照組,為不加谷氨酸的骨髓基質(zhì)細胞,B、C、D組分別為

10、加入10、30、50mmol/l的谷氨酸和骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)24h,用Hoechst33342做熒光染色,熒光顯微鏡觀察并記錄各組高倍鏡下50個細胞中正常和異常細胞的數(shù)量,計算各組細胞的存活率,采用one-way ANOVA統(tǒng)計各組細胞存活率的差異,方差齊性時用LSD檢驗,方差不齊時用Dunnett T3檢驗,P<0.05表示有統(tǒng)計學差異；流式細胞儀采用Annexin-V/PI染色檢測各組細胞的存活率和凋亡、壞死率。
　　 結(jié)論

11、:1.采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法可獲得骨髓基質(zhì)細胞,經(jīng)傳代后細胞貼壁生長,增殖旺盛,純化程度高；
　　 2.大鼠骨髓基質(zhì)細胞表面標志為CD 29、CD 44、CD90陽性,CD34陰性；
　　 3.谷氨酸可以誘導的骨髓基質(zhì)細胞凋亡,隨著谷氨酸濃度的增加,細胞的壞死和凋亡率增加。
　　 第二部分 粒細胞集落刺激因子對谷氨酸誘導的骨髓基質(zhì)細胞凋亡的影響
　　 目的：采用不同濃度的粒細胞集落刺激因子和骨髓基

12、質(zhì)細胞共培養(yǎng),然后用谷氨酸誘導骨髓基質(zhì)細胞的凋亡,了解粒細胞集落刺激因子對谷氨酸誘導的骨髓基質(zhì)細胞凋亡的影響。
　　 方法:按照第一部分方法獲得骨髓基質(zhì)細胞,體外培養(yǎng)純化及擴增骨髓基質(zhì)細胞；實驗分組為A、B、C、D四組,分別為正常BMSCs對照組及應用0、10、50ng/ml的G-CSF和骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)6h后加入30mmol/l谷氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h,各組均用Hoechst33342做熒光染色,熒光顯微鏡觀察并記錄高倍鏡下50

13、個細胞中正常和異常細胞的數(shù)量,計算各組細胞的存活率,采用one-way ANOVA統(tǒng)計各組細胞存活率的差異,方差齊性時用LSD檢驗,方差不齊時用Dunnett T3檢驗,P<0.05表示有統(tǒng)計學差異；流式細胞儀采用Annexin-V/PI染色檢測各組細胞的存活率和凋亡,壞死率。
　　 結(jié)論:體外實驗中一定濃度的G-CSF可以減低谷氨酸誘導的BMSCs凋亡和壞死,提高細胞的存活率。
　　 第三部分 骨髓基質(zhì)細胞聯(lián)合粒細胞集

14、落刺激因子治療大鼠脊髓全橫斷損傷
　　 目的：制作大鼠脊髓全橫斷損傷模型,移植骨髓基質(zhì)細胞,并聯(lián)合應用粒細胞集落刺激因子,觀察其對大鼠脊髓全橫斷損傷后神經(jīng)功能恢復的影響。
　　 方法:按照第一部分方法體外培養(yǎng)純化及擴增骨髓基質(zhì)細胞,用Hoechst33342做細胞的標記,分組行BMSCs和G-CSF治療。取雌性SD大鼠60只,隨機分為4組,每組15只。A組(對照組),大鼠行脊髓全橫斷手術,術后注射生理鹽水對照；B組(G-

15、CSF治療組),大鼠行脊髓全橫斷手術后給以G-CSF 50ng/kg/d,連用5天后停止；C組(BMSCs治療組),大鼠行脊髓全橫斷手術后給以10μl含有3×106個BMSCs損傷部位直接注射；D組(BMSCs+G-CSF治療組),大鼠行脊髓全橫斷手術后給以10μl含有3×106BMSCs損傷部位直接注射,同時給以G-CSF 50ng/kg/d,連用5天后停止。術后每組9只大鼠每周觀察其下肢BBB運動功能評分,連續(xù)8周,采用重復測量的方

16、差分析檢驗每周時各組大鼠BBB評分差異；并在2周、4周、8周后每組各3只鼠用于取材做免疫組化,HE染色等觀察損傷部位的情況變化,計數(shù)2周時各組caspase-3陽性細胞,4周時NSE、GFAP陽性細胞的數(shù)量,采用one-way ANOVA檢驗各組陽性細胞的統(tǒng)計差異,方差齊性時用LSD檢驗,方差不齊時用Dunnett T3檢驗,P<0.05表示有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.粒細胞集落刺激因子可以抑制脊髓全橫斷大鼠