1、細(xì)胞移植是近年眾多領(lǐng)域的研究熱點，肝臟干細(xì)胞移植經(jīng)過30多年的發(fā)展，已由動物實驗向臨床過渡。初步結(jié)果顯示，來自于骨髓的干細(xì)胞，在體內(nèi)與體外均能分化為功能完備的肝細(xì)胞，細(xì)胞移植在急慢性肝衰竭和遺傳代謝性肝病方面具有很好的前景。用骨髓干細(xì)胞替代成熟肝細(xì)胞進(jìn)行移植，有望使細(xì)胞移植在肝病治療方面取得重大突破。但移植細(xì)胞的活體示蹤以及進(jìn)一步的療效觀察卻一直是面臨的難題。Weissleder于1999年提出分子影像學(xué)(molecularimagin

2、g,MI)概念后，分子影像學(xué)已經(jīng)成為影像醫(yī)學(xué)和相關(guān)臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點。研究者采用氧化鐵顆粒標(biāo)記移植細(xì)胞進(jìn)行了廣泛的磁共振(MRI)活體示蹤研究。國內(nèi)的相關(guān)實驗研究也開始起步。本實驗采用超順磁性氧化鐵(superparamagneticironoxide，SPIO)(德國Schering公司)實施體外標(biāo)記，進(jìn)行干細(xì)胞MR成像以及活體肝臟移植細(xì)胞的MR示蹤研究，探討標(biāo)記干細(xì)胞體外成像的要素，及標(biāo)記干細(xì)胞在正常肝臟的成像特點和代謝規(guī)律等，為采

3、用細(xì)胞移植技術(shù)治療肝功能衰竭，提供實驗研究依據(jù)。 目的探討SPIO標(biāo)記兔骨髓干細(xì)胞的方法、濃度、細(xì)胞量以及不同標(biāo)記濃度對細(xì)胞分裂增殖、貼壁、遷移能力的影響；探討標(biāo)記細(xì)胞的體外磁共振成像及其特點；探討標(biāo)記干細(xì)胞肝內(nèi)植入后磁共振成像特點和衰減規(guī)律。 方法選擇體重1.5～2.0kg成年家兔20只。穿刺髂骨，抽取骨髓，分離培養(yǎng)兔骨髓干細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入HGF和bFGF誘導(dǎo)細(xì)胞在體外增殖、分化。利用干細(xì)胞的吞噬能力，在培養(yǎng)液

4、中加入不同濃度的SPIO標(biāo)記干細(xì)胞，觀察、對比不同標(biāo)記濃度對細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。在標(biāo)記后的適當(dāng)時間，將細(xì)胞懸浮于Ependoff管內(nèi)行MR掃描。將適當(dāng)濃度SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞，在B超引導(dǎo)下穿刺注入同體家兔的肝臟內(nèi)。在注射后1天、3天、1周、2周以及1月等不同時間，對家兔肝臟行T1W、T2W、TFE序列的磁共振掃描，動態(tài)觀察直至信號消失。取肝臟標(biāo)本行HE和普魯士蘭染色，觀察移植細(xì)胞在肝內(nèi)的遷徙。 結(jié)果1.BMSC的原代培養(yǎng)：骨髓

5、干細(xì)胞懸液接種后24h開始有細(xì)胞貼壁。72h完全換液后可見貼壁細(xì)胞分裂增殖。培養(yǎng)5～7d后細(xì)胞分裂增殖明顯，出現(xiàn)形態(tài)均一的細(xì)胞增殖集落，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，約8～12d后貼壁生長的細(xì)胞即可融合形成單層結(jié)構(gòu)。 2.BMSC的體外標(biāo)記觀察及標(biāo)記率測定：孵化過夜后，倒置顯微鏡觀察所有細(xì)胞，見胞漿內(nèi)有或多或少的黑色鐵顆粒，標(biāo)記率接近100％。 3.四甲基偶氮唑蘭(MTT)比色法檢測細(xì)胞的增殖能力，得出細(xì)胞生長曲線圖，證實用35u

6、gFe/ml濃度的SPIO標(biāo)記的細(xì)胞，具有與未標(biāo)記細(xì)胞一樣的增殖能力。 4.標(biāo)記后的BMSC體外MRI成像顯示，在T1W、T2W、和TFE序列均可見信號改變，以T2WI和TFE較明顯。 5.細(xì)胞移植后MRI活體內(nèi)示蹤：正常對照組1未標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞注入肝臟左葉后MRI均未顯示；正常對照組2注射單純SPIO后24h內(nèi)均可顯示低信號團(tuán)，但24h后則顯示不明顯，30h后完全不顯示；標(biāo)記高濃度SPIO的干細(xì)胞注射組，在T1WI、

7、T2WI和TFE等MRI圖像上，肝臟左葉標(biāo)記細(xì)胞注射區(qū)域出現(xiàn)信號減低，以TFE信號減低最為顯著且有靶區(qū)面積增大效應(yīng)(磁敏感效應(yīng))。同時間點不同序列靶區(qū)信號降低程度不盡相同，即TFE＞T2WI＞T1WI。不同時間點同一序列靶區(qū)逐漸變小，在T1WI和T2WI的改變較為一致，而TFE的靶區(qū)減小緩慢。無論T1WI圖像，還是T2WI圖像和TFE圖像均顯示，注射標(biāo)有SPIO干細(xì)胞后，隨著時間的延長直到術(shù)后30d，靶區(qū)信號強度與術(shù)前相比均有顯著性的變

8、化(P＜0.01)，而且在術(shù)后50d，注射部位仍可見低信號區(qū)域。 結(jié)論1.Ficoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可以用來分離家兔的BMSC，獲得單核的細(xì)胞純度和存活率較高，細(xì)胞的功能保持的較好。以1×106/ml的細(xì)胞濃度接種培養(yǎng)可獲得良好的細(xì)胞分化和增殖。 2.用35ugFe/ml的SPIO培養(yǎng)液標(biāo)記BMSC，可獲得理想的標(biāo)記率而且細(xì)胞的增殖能力不受影響。1×105/ml以上的標(biāo)記細(xì)胞濃度可獲得理想的MR信號強度。