1、目的：從世界范圍來看,在乳腺所發(fā)生的各種類型病變中乳腺癌是主要的致死原因,其發(fā)病率正逐年升高,現(xiàn)在在女性各種惡性腫瘤中已經(jīng)排名第一位,并逐漸向年輕化發(fā)展,而且越是年輕的患者,其乳腺癌的病理類型往往提示侵襲性越高,預后也越差。因此,進一步深入的理解和研究乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)展機理,對如何早期發(fā)現(xiàn)以及減少乳腺癌的發(fā)病率相關因素的影響,進而對提高乳腺癌患者的生存率、改善生活質量和降低發(fā)病率具有十分重要的意義。近年來大量研究表明乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)

2、展是多個基因共同起作用,經(jīng)過多個步驟逐步導致的結果。盡管近年來乳腺癌的發(fā)病率不斷增加,但是隨著分子生物技術的進展以及分子標記物的發(fā)現(xiàn)等診療技術的進步,都為乳腺癌有效的靶向治療提供了更多的可能性,因此對乳腺癌發(fā)生有關的易感基因及其相關基因產(chǎn)物的研究逐漸成為腫瘤學關注和深入探索的焦點問題,引起了眾多學者的極大興趣,同時也取得了很大成就。KLF(Krüppel-likefactor)家族是真核生物中一大類基礎轉錄因子(basictranscr

3、iptionelement-bindingprotein,BTEB),是黑腹果蠅中含有鋅指結構的一種具有特征性的轉錄因子,大量哺乳動物基因的DNA結合域都包含有類似的結構,因此與Krüppel均具有序列同源性。在結構上,和20世紀80年代早期發(fā)現(xiàn)的Sp1蛋白因子(specificprotein1)家族具有高度的相似性,都具備一個由3個串聯(lián)富含GC/GT的Cys2His2組成的羧基端,至少由16個各異的成分組成,并且根據(jù)該結構,我們可以劃

4、分出幾個不同的亞型,在細胞分化、增殖、凋亡、血管的生成以及胚胎形成過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用,同時很可能與乳腺癌的惡性程度、發(fā)生遠處轉移的幾率以及患者預后有十分密切的關系,是一種最重要的真核生物中的基礎調控因子。KLF4(Krüppel-likefactors4)是KLF家族的成員之一,在多種細胞的生長、增殖、分化及細胞重編程等多種生物學過程執(zhí)行著重要功能,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉歸有關。KLF4在特定的組織中以細胞依賴的方式發(fā)揮抑

5、癌作用或者致癌作用,在早期腸腺瘤、結腸腺瘤以及直腸、食管、膀胱、前列腺、頭頸部等多種惡性腫瘤中均經(jīng)研究證實存在著KLF4的表達量以及表達方式的改變。然而,KLF4表達下調并不一定發(fā)生在所有類型和組織來源的腫瘤中,例如在口腔癌中KLF4的特點卻是表達量的增加,并且它在腫瘤細胞中的定位與腫瘤的侵襲性以及惡性程度緊密相聯(lián)。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學行為是在多個分子信號通路的調控下發(fā)生的,而轉錄因子在調控這些通路的過程中充當了重要角色,有研究表

6、明乳腺癌與真核鋅指蛋白轉錄因子中關系最密切的是KLF4(即胃腸富集因子Krüppel樣因子),然而目前現(xiàn)有的有關轉錄因子KLF4與乳腺癌之間關系的研究報道尚存在很大的爭議。因此,研究在乳腺癌中轉錄因子KLF4的表達變化情況和趨勢,這些變化對乳腺癌細胞生物學行為以及患者的預后和轉歸帶來的影響,在乳腺癌形成過程中所發(fā)揮的作用以及分子機制,對進一步認識乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、分級、分期、及早發(fā)現(xiàn)以及臨床治療等眾多方面都具有極其深遠的影響。本課題通

7、過采用(1)Westernblot檢測不同濃度及不同時間TNFα刺激下乳腺癌細胞中KLF4蛋白的表達情況;(2)采用流式細胞術技術檢測刺激因子作用下乳腺癌細胞的周期以及凋亡的情況;(3)腺病毒載體介導KLF4過表達,采用DAPI染色技術檢測穩(wěn)定轉染細胞的凋亡程度。旨在從細胞、分子水平上分析乳腺癌細胞中轉錄因子KLF4的表達與乳腺癌細胞凋亡的相關性,為更有效的治療乳腺癌提供新的靶點。
　　方法：采用不同濃度TNFα(0、1、5、10

8、、20ng/mL)相同作用時間(24小時)以及相同濃度(10ng/mL)不同時間(0、6、12、24、34小時)刺激SK-BR-3乳腺癌細胞,提取蛋白后應用Western印跡分析的方法檢測KLF4的表達水平;應用流式細胞術和DAPI染色的方法分析不同濃度以及不同時間刺激因子作用下對乳腺癌細胞的作用以及質粒轉染后乳腺癌細胞的凋亡情況,并對比加入刺激因子前后乳腺癌細胞形態(tài)學的改變以及凋亡情況。應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理,所有數(shù)據(jù)以

9、均數(shù)±標準差(x±S.D.)表示。均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析(One-wayANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：不同濃度TNFα(0、1、5、10、20ng/mL)刺激SK-BR-3乳腺癌細胞24小時后,隨著刺激濃度的增高,KLF4表達水平呈劑量依賴性逐漸增多;相同濃度(10ng/mL)不同時間TNFα(0、6、12、24、34小時)作用下的結果顯示,隨著對乳腺癌細胞刺激時間的增加,KLF4的表達水

10、平以時間依賴性的方式逐漸遞增;流式細胞術和DAPI染色顯示,TNFα可以誘導SK-BR-3乳腺癌細胞的凋亡,并且隨著刺激劑量和時間的增加,細胞核固縮程度顯著加重,細胞凋亡程度明顯提高;構建pAd-EGFP和pAd-EGFP-KLF4腺病毒表達載體,在SK-BR-3乳腺癌細胞中過表達EGFP或EGFP-KLF4,再給予TNFα刺激后,DAPI染色和流式細胞術觀察結果經(jīng)對比顯示,KLF4過表達之后乳腺癌細胞核固縮程度較大,而且可以明顯促進S