1、食管癌是我國最常見的消化道腫瘤之一。雖然隨著外科、麻醉、圍手術(shù)期處理以及重癥監(jiān)護(hù)條件和技術(shù)取得較大的提高，但是單純手術(shù)治療效果仍不理想。其原因在于食管癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制目前仍不清楚，導(dǎo)致食管癌療效欠佳。腫瘤細(xì)胞代謝異常是腫瘤細(xì)胞顯著區(qū)別于正常細(xì)胞的顯著特征之一。從腫瘤代謝的角度尋找食管癌的治療靶點(diǎn)很可能為食管癌的治療帶來新的希望。甲羥戊酸(MVA, Mevalonate)途徑除了終產(chǎn)物膽固醇外，還能產(chǎn)生許多中間代謝產(chǎn)物，如類異戊二烯

2、，泛醌等。這些物質(zhì)在細(xì)胞重要的生理過程中發(fā)揮作用。甲羥戊酸代謝途徑在食管鱗癌發(fā)生中的功能目前仍不清楚。
　　在本研究中，我們克隆了甲羥戊酸代謝限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR)，并對(duì)其進(jìn)行了功能和所涉機(jī)制的初步研究。在本研究中，我們收集食管鱗癌組織標(biāo)本，培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞系，利用熒光定量PCR檢測食管鱗癌組織及其配對(duì)

3、的正常組織中HMGCR的mRNA水平，利用蛋白印跡檢測食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞中HMGCR的蛋白水平。在細(xì)胞水平上，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞，建立過表達(dá)HMGCR的食管鱗癌穩(wěn)定細(xì)胞株;設(shè)計(jì)RNA干擾序列，下調(diào)HMGCR在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)。我們利用MTT實(shí)驗(yàn)、Boyden Chamber和軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)分析HMGCR對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生長、遷移和克隆形成的影響;利用GST-pulldown和蛋白印跡檢測HMGCR對(duì)Ras-ERK信

4、號(hào)通路的活化作用。最后，我們?cè)谑彻荀[癌細(xì)胞中過表達(dá)或下調(diào)c-Myc的表達(dá)，通過熒光定量PCR和蛋白印跡檢測c-Myc的表達(dá)對(duì)HMGCR mRNA和蛋白水平的影響。
　　我們的研究結(jié)果顯示，與正常食管粘膜組織相比，HMGCR在食管鱗癌組織中的mRNA水平和蛋白水平均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。HMGCR在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平高于永生化的食管粘膜上皮細(xì)胞。在食管鱗癌細(xì)胞Eca109和正常食管粘膜細(xì)胞SHEE中過表達(dá)HMGCR促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞生

5、長、遷移和在軟瓊脂上克隆集落;在食管鱗癌細(xì)胞Eca109和Caes-17中下調(diào)HMGCR的表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞遷移和在軟瓊脂上克隆集落。在分子機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)HMGCR過表達(dá)促進(jìn)Ras活化，上調(diào)ERK磷酸化水平。在食管鱗癌細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)代謝的重要調(diào)控因子c-Myc上調(diào)HMGCR的mRNA水平和蛋白水平。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果提供了充分的證據(jù)，證明HMGCR在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要功能。同時(shí)，我們的研究也提示HM

6、GCR的抑制劑他汀用于食管鱗癌治療的可能性。本研究可以分為如下三個(gè)部分:
　　第一部分 HMGCR在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
　　目的:研究HMGCR在食管鱗癌組織及配對(duì)的正常組織、食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)模式。
　　方法:首先利用熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測HMGCR在40例食管鱗癌組織及配對(duì)的正常組織中的mRNA水平;使用蛋白印跡法，檢測隨機(jī)挑選的6例食管鱗癌組織及配對(duì)的正常組織中HM

7、GCR的蛋白水平，驗(yàn)證熒光定量PC結(jié)果;最后，利用蛋白印跡檢測正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞中HMGCR的蛋白水平。
　　結(jié)果:mRNA水平的檢測結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中HMGCR的mRNA水平較配對(duì)的正常組織顯著升高;蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食管鱗癌組織中HMGCR的蛋白水平較配對(duì)的正常組織顯著上調(diào)，這一結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致;最后，對(duì)多種食管鱗癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞的蛋白印跡結(jié)果顯示，HMGCR在正常食管上皮細(xì)胞中的表

8、達(dá)水平較低，在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。
　　結(jié)論:在食管鱗癌組織和細(xì)胞系中，HMGCR的mRNA水平和蛋白水平均有較強(qiáng)的表達(dá)。與正常組織相比較，食管鱗癌組織中HMGCR的表達(dá)水平上升;與正常食管上皮細(xì)胞相比，HMGCR在鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平升高。這些結(jié)果提示HMGCR在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中很可能起著非常重要的作用。
　　第二部分 HMGcR對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生長、遷移和克隆集落的影響
　　目的:研究HMGCR對(duì)食管

9、鱗癌細(xì)胞惡性行為（如生長、遷移、克隆集落等）的影響，揭示HMGCR在食管鱗癌進(jìn)展中的功能。
　　方法:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HMGCR的表達(dá)載體（myc-HMGCR，帶myc標(biāo)簽）至食管鱗癌細(xì)胞Eca109和正常食管上皮細(xì)胞SHEE中;通過MTT法檢測HMGCR對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca109和正常食管上皮細(xì)胞SHEE生長的影響;通過軟瓊脂集落法研究HMGCR對(duì)食管鱗癌細(xì)胞克隆形成能力的影響;借助于細(xì)胞遷移模型揭示HMGCR對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca

10、109和正常食管上皮細(xì)胞SHEE遷移的影響。同時(shí)，制備HMGCR RNA干擾的病毒載體，在食管鱗癌細(xì)胞Eca109、Caes17中下調(diào)HMGCR的表達(dá);利用軟瓊脂集落法揭示下調(diào)HMGCR的表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞克隆形成的影響;借助細(xì)胞遷移模型研究HMGCR表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　結(jié)果:通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在食管鱗癌細(xì)胞Eca109和正常食管上皮細(xì)胞SHEE中建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，過表達(dá)帶myc標(biāo)簽的HMGCR。

11、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)HMGCR促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞Ecal09、正常食管上皮細(xì)胞SHEE的生長;細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，HMGCR在Eca109和SHEE細(xì)胞中的表達(dá)增加食管鱗癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力;軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，HMGCR在Eca109細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)其非錨定性生長。此外，我們構(gòu)建了HMGCR RNA干擾的慢病毒載體，非常有效地干擾HMGCR在食管鱗癌細(xì)胞Eca109和Caes17中的表達(dá)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，HMGCR表達(dá)下降削弱了

12、食管鱗癌細(xì)胞Eca109和Caes17的運(yùn)動(dòng)能力;克隆集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，干擾HMGCR的表達(dá)使食管鱗癌細(xì)胞的非錨定性生長的能力受到抑制。
　　結(jié)論:HMGCR促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的生長、遷移、克隆形成能力，干擾HMGCR的表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞非錨定性生長和遷移。HMGCR對(duì)食管鱗癌的進(jìn)展發(fā)揮促進(jìn)作用。
　　第三部分 HMGCR在食管鱗癌細(xì)胞中激活Ra s-ERK信號(hào)通路
　　目的:研究HMGCR調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞惡性行為（如

13、生長、遷移和克隆集落）的分子機(jī)制。
　　方法:利用GST-pull down平臺(tái)，研究HMGCR的表達(dá)Ras的活化作用及對(duì)ERK磷酸化水平的影響;通過熒光定量PCR和蛋白印跡，檢測c-Myc基因的表達(dá)對(duì)HMGCR的mRNA水平和蛋白水平的影響。
　　結(jié)果:GST-pull down分析顯示，過表達(dá)HMGCR促進(jìn)Ras的活化，上調(diào)ERK的磷酸化水平。干擾HMGCR的表達(dá)抑制ERK的磷酸化。熒光定量PCR和蛋白印跡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示