1、研究背景與目的：食管鱗癌(Esophageal squamous cell cancer，ESCC)，它是來自食道上皮細胞的原發(fā)性食管癌的其中一種類型，在世界范圍內(nèi)尤其是在中國有著很高發(fā)病率的一種惡性腫瘤。ESCC的目前的治療技術包括手術、放療和化療，盡管目前隨著早期診斷和治療方法上的進步，但ESCC卻仍然是致死率很高的惡性腫瘤之一。在我國的食管癌患者中，約有90％以上的患者病理類型為食管鱗狀細胞癌。在解剖上，食管組織結構與其他消化管道

2、存在差異，在食管的粘膜固有層和粘膜肌層中含有豐富的淋巴管道，因此，以至于在T分期較早的食管癌中也可以發(fā)生淋巴結的轉移。資料顯示，在手術完全切除的食管癌患者中，仍有許多早期患者在完全切除腫瘤后的2-3年之內(nèi)仍然出現(xiàn)淋巴結的轉移性復發(fā)。因此發(fā)現(xiàn)新的、有效的抗食管鱗癌的方法是當務之急。隨著廣大研究者對腫瘤分子機制不斷的深入認識，現(xiàn)在已將惡性腫瘤定義為一種多因子、多步驟和多基因參與的全身性疾病。因此，在近幾年中，腫瘤的生物學治療以及基因治療成為

3、腫瘤治療的研究熱點和新希望。
　　許多研究表明食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素，多步驟和多個基因參與的結果。抑癌基因也稱作隱性癌基因，這類基因在控制細胞生長、增殖及分化過程中起著十分重要的負性調(diào)節(jié)作用，并能潛在地抑制腫瘤生長。如果抑癌基因的功能失活或出現(xiàn)基因缺失、突變等異常，就可能導致細胞發(fā)生惡性轉化進而導致腫瘤的發(fā)生。腫瘤抑制基因的失活和變異的機制參與ESCC通過遺傳和表觀遺傳異常的積累發(fā)展，演變從蔓延前的侵入性食管癌病變，一般以惡

4、性細胞表現(xiàn)出異常的重要基因表達。因此，發(fā)現(xiàn)參與ESCC腫瘤發(fā)生和發(fā)展的新基因，在探索食管鱗癌的生成和發(fā)展中具有重要的臨床價值。
　　Runt相關轉錄因子3(runt-related transcription factor3 gene，RUNX3)蛋白是轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)信號轉導通路的一個轉錄因子，它是哺乳動物Runt家族進化的基礎，其定位于人染色體1號短臂

5、1p36上。Runt家族成員均具有含123個氨基酸RuntDomain(RD區(qū)域)，Runx蛋白與Smad2、Smad3形成復合物傳遞TGF-β/activin信號，與人類疾病的發(fā)生密切相關。RUNX3對細胞生長起負性調(diào)節(jié)，在TGF-β介導的細胞周期調(diào)控、細胞分化與凋亡過程中起到重要的作用。RUNX3首先在胃癌中發(fā)現(xiàn)，其廣泛表達于多種細胞中，如消化道上皮細胞、間葉細胞、血液細胞及神經(jīng)細胞等，與細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡有關，其缺失或失活

6、都可導致多種消化系惡性腫瘤的發(fā)生而倍受關注。
　　臨床試驗證實RUNX3陰性表達時腫瘤中淋巴道侵襲能力和淋巴結轉移數(shù)目均明顯增高，RUNX3陰性表達與食管鱗癌預后不良相關，可能是影響預后的重要因素，即RUNX3蛋白表達下調(diào)與食管鱗癌的臨床TNM分期及淋巴結轉移相關，參與食管癌變進展過程。但是目前尚沒有關于RUNX3對食管鱗癌細胞分子水平作用研究的相關報道。本研究通過應用免疫組織化學、western-blot免疫印跡、實時定量-聚合

7、酶聯(lián)反應的實驗方法分別從蛋白和基因的不同角度研究了RUNX3在食管鱗癌組織中的表達以及對食管鱗癌細胞系生物學活性和腫瘤發(fā)生的相關性，并探討了RUNX3與食管鱗癌各臨床病理特征及預后之間的關系。旨在為探索食管癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找特異的預后指標，為食管鱗癌的治療確定新的治療目標和提供基因治療食道癌的理論基礎。
　　第一部分 RUNX3過表達在體內(nèi)體外對食管鱗癌Eca109細胞系的生物學行為抑制的研究
　　目的：探討RUNX3

8、基因表達與食管鱗癌患者的臨床相關性的關系以及食管鱗癌細胞系Eca109過表達RUNX3后體外和體內(nèi)的生物學行為改變。
　　方法：免疫組織化學檢測食管鱗癌患者RUNX3的表達與其淋巴結轉移的臨床相關性，構建并用RT-PCR和Western-blotting檢驗穩(wěn)定過表達RUNX3的Eca109細胞系。細胞免疫熒光染色鑒定RUNX3蛋白的定位。CCK-8、細胞劃痕試驗被用來確定Eca109細胞的增殖情況。TUNEL實驗是分析過表達后細

9、胞的凋亡。Transwell侵襲實驗對比檢測細胞的侵襲能力。通過裸鼠成瘤實驗分別驗證過表達前后體內(nèi)腫瘤生長的能力。
　　結果：相比在食管癌周圍的正常食管上皮組織，RUNX3蛋白在食管鱗癌中表達較低。證實在食管組織中RUNX3的表達與食管鱗癌淋巴結轉移顯著相關(LNM)(P＜0。01)。我們成功構建并驗證了穩(wěn)定過表達RUNX3的Eca109細胞系，發(fā)現(xiàn)RUNX3過表達能抑制細胞增殖，遷移和侵襲，并且誘導Eca109細胞的凋亡。在裸鼠

10、體內(nèi)實驗中顯著地抑制Eca109細胞的致瘤性。
　　結論：人類食管鱗癌組織RUNX3表達與ESCC進展顯著相關。RUNX3的過表達顯著抑制ESCC細胞增殖、遷移、入侵和致瘤性。
　　第二部分 RUNX3基因阻抑食管鱗癌細胞生長的分子機制
　　目的：探討RUNX3過表達及沉默后食管鱗癌細胞生物學行為及RUNX3與MMP-9，TIMP-1，ICAM-1之間的關系。
　　方法：采用免疫組織化學染色檢查90例食管鱗狀細胞

11、癌標本RUNX3表達以及探討RUNX3的表達與食管鱗癌階段的相關性。通過構建穩(wěn)定過表達RUNX3及沉默RUNX3的食管鱗癌細胞系，驗證RUNX3的改變與MMP-9，TIMP-1和ICAM-1表達作用的關系。
　　結果：發(fā)現(xiàn)降低ESCC組織中RUNX3表達與腫瘤的T分期顯著相關(P＜0。01)。體外實驗中沉默RUNX3導致促進Eca9706細胞生長，細胞遷移和侵襲。并且RUNX3的降低調(diào)節(jié)MMP-9和ICAM-1在食管鱗癌細胞中的表

12、達。相反，在RUNX3過表達Kyse150細胞系中MMP-9，ICAM-1顯著減少。
　　結論：研究表明，食管鱗癌中RUNX3的表達與食管鱗癌的發(fā)展顯著相關。恢復RUNX3的表達顯著抑制ESCC細胞遷移、侵襲和腫瘤發(fā)生，這可能是由于RUNX3與MMP-9ICAM-1的表達有關，RUNX3在食管鱗癌中可能是一個潛在的治療目標。
　　第三部分 5-氮雜胞苷對食管癌細胞生物學行為影響及其機制探討
　　目的：探討去甲基化試劑5

13、-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-azac)上調(diào)RUNX3基因表達后，食管癌Eca109細胞生物學行為的改變。
　　方法：體外培養(yǎng)的Eca109細胞，應用10、20和50μtmol/L較低濃度的5-氮雜胞苷干預72h，實時定量PCR及蛋白質印跡法檢測RUNX3基因的mRNA及蛋白表達水平改變，甲基化特異性PCR檢測RUNX3基因的甲基化程度變化，細胞劃痕、Transwell實驗觀察Eca109細胞遷移及侵襲能力的改變。<

14、br>　　結果：經(jīng)10、20和50μmol/L5-氮雜胞苷干預72h后，RUNX3基因的mRNA表達水平分別增加2.18±0.23、4.57±0.26和6.90±0.36倍，RUNX3蛋白表達相對系數(shù)分別為0.196±0.004、0.278±0.013和0.396±0.025。Eca109細胞經(jīng)5-氮雜胞苷處理后，部分RUNX3基因去甲基化。0、20和50μtmol/L5-氮雜胞苷干預72h后，RUNX3基因的去甲基化條帶亮度值比值分別

15、為0.125±0.003、1.791±0.112和2.987±0.236(P＜0.001)。0、10、20和50μtmol/L5-氮雜胞苷干預72h后，Eca109細胞運動至劃痕處細胞數(shù)分別為715±20.1、398±19.3、302±16.4和124±13.8。相比于對照組，10、20和50μtmol/L干預組遷移細胞數(shù)百分率分別為62％、46％和12％，侵襲細胞數(shù)百分率為60％、45％和8％。
　　結論：較低濃度5-氮雜胞苷通