1、背景和目的: 骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤。肺轉移是目前最常見的死亡原因，一旦發(fā)生預后明顯變差，不可切除的肺轉移死亡率幾乎達100％。如何提高肺轉移治愈率一直是臨床研究的熱點和難點。臨床上約50％患者的肺轉移是在治療過程中出現的。如果能在治療早期采用某種方法阻止肺轉移的發(fā)生，將明顯提高骨肉瘤的治愈率，是減少肺轉移致死率的最佳方法。 腫瘤的遠處轉移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)共同參與的復雜過程，眾多活性因子參與其中。Ezrin

2、被認為是腫瘤轉移各環(huán)節(jié)、各通路的中心調控因子。已經發(fā)現Ezrin與多種惡性腫瘤的預后和轉移相關。2001年，Khanna最先發(fā)現Ezrin在高轉移骨肉瘤細胞株明顯過度表達。后來，進一步研究證實抑制Ezrin表達能顯著下調骨肉瘤細胞在肺內的存活能力。提示Ezrin可能成為基因治療抑制骨肉瘤轉移的一個靶點。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是最近發(fā)展起來的一種高效的基因沉默技術，具有特異性強、效率高、操作簡單

3、、沉默程度可控、實驗周期短、適用范圍廣、費用低等無可替代的優(yōu)點。因而，一經發(fā)現就得到了迅猛發(fā)展，現已廣泛用于基因功能、腫瘤、抗病毒治療等方面的研究。目前關于Ezfin參與腫瘤轉移方面的體內研究主要采用的是實驗性肺轉移模型，由于模型動物的限制不能如實反映臨床骨肉瘤肺轉移的過程，也不能研究Ezrin對原發(fā)灶的影響。因此本實驗擬在以上研究的基礎上，通過構建抑制Ezrin蛋白表達的shRNA干擾重組載體，下調UMR106大鼠骨肉瘤細胞株Ezfi

4、n蛋白的表達，體外研究干擾前后細胞增殖、運動、粘附和侵襲能力的改變；并以大鼠原位骨肉瘤荷瘤鼠做為腫瘤模型，體內觀察Ezrin蛋白干擾對骨肉瘤肺轉移及原位瘤生長的影響，為研究抑制骨肉瘤肺轉移的基因治療方法提供理論依據。 方法: (1)按照Elbashir等及Reynolds的設計原則設計并合成針對Ezrin蛋白編碼基因villin2的shRNA，并克隆入轉錄載體pGenesil-1，構建重組質粒pshRNA1-viUin2

5、，pshRNA2-viUin2和pshRNAHK-villin2(陰性對照質粒)；中量提取重組質粒，采用Lipofectamine<'TM> 2000轉染UMR1069胃肉瘤細胞，應用RT-PCR和Western Blot法分別在mRNA和蛋白水平檢測villin2基因的干擾效果。 (2)應用干擾效果較好的質粒大量轉染UMR106細胞，體外應用MTT、細胞粘附實驗和Transwell小室分別研究Ezrin蛋白干擾后細胞增殖、粘附

6、、運動和侵襲能力的變化。 (3)采用LYMR106細胞原位移植法構建高肺轉移率的大鼠骨肉瘤模型。分別用無血清培養(yǎng)基和鼠尾膠稀釋擴增培養(yǎng)的UMR106細胞形成混懸液，原位移植至3周齡SD大鼠脛骨近端骨髓腔內，并給予免疫抑制劑和抗感染藥物。觀察肢體成瘤及肺內轉移情況，X線檢查骨質改變狀況，HE染色組織學檢查確定病變性質。 (4)應用G418篩選穩(wěn)定轉染重組質粒的UMR106細胞并進行大量擴增，按照(3)的方法建立SD大鼠原位

7、移植骨肉瘤，以正常細胞及陰性對照質粒轉染細胞的移植模型做對照，觀察原位腫瘤出現時間、大鼠生存時間及肺轉移的差異，并采用熒光顯微鏡和RT-PCR技術研究Ezrin蛋白被干擾細胞的體內分布。 結果: (1)成功構建三個重組質粒，分別為pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2和通用陰性對照質粒pshRNAHK-villin2；應用Lipofectamine<'TM>2000將上述重組質粒成功轉染至UMR1

8、06骨肉瘤細胞內，轉染效率高達90％。RT-PCR檢測顯示villin2基因在mRNA轉錄水平被顯著抑制，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-Villin2分別抑制到正常細胞的23.12％和30.25％。Western Blot檢測結果與RT-PCR相似，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-villin2分別將Ezrin蛋白抑制到正常細胞的12.32％和25.56％，pshRNA1-villin2干擾效果較好。

9、 (2)以重組質粒pshRNA1-villin2轉染UMR106細胞干擾Ezrin蛋白表達后細胞發(fā)生以下變化：①細胞增殖能力減弱，增殖抑制率達26.63％±20.65％；②細胞粘附力降低，僅為正常細胞的52.9％；③細胞運動及侵襲能力均降低，抑制率分別45.34±5.91％和50.69±5.96％。 (3)UMR106細胞混懸液原位移植SD大鼠脛骨近端骨髓腔成功構建了高肺轉移的大鼠骨肉瘤模型，原位成瘤率及肺轉移率均達100％。

10、X線檢查示明顯骨質破壞和瘤骨形成，組織學檢查見腫瘤樣骨基質形成，符合臨床骨肉瘤各項特征。培養(yǎng)基稀釋組較鼠尾膠稀釋組腫瘤形成時間早(10.0±1.65天 vs 17.8±0.87天，p<0.0001)，肺轉移灶數目多(155.25±36.63個vs 91.5±29.56個，p<0.0001)，大鼠生存時間短(21.4±6,67天 vs40.6±9.52天，p<0.0001)。 (4)以重組質粒pshRNA1-villin2轉染UM

11、R106細胞，G418篩選并擴增培養(yǎng)2個月，UMR106的穩(wěn)定轉染細胞達細胞總數的50％以上，RT-PCR檢測示mRNA為正常細胞的60.25％，Western Blot檢測Ezrin蛋白降至正常細胞的50.56％。將篩選后細胞原位移植大鼠脛骨近端，結果證實：①Ezrin蛋白干擾后并未影響UMR106細胞原位腫瘤的形成，成瘤時間與正常細胞組和陰性對照組間無統(tǒng)計學差異(10.17±0.90天 vs 10.17±0.95天和10.08±0.

12、88天，p>0.05)；②存活時間較正常細胞組和HK陰性對照組明顯延長(42.8±17.28天 vs 21.3±6.72天和22.4±7.42天，p<0.0001)；③肺轉移灶數目明顯少于正常細胞組和HK陰性對照組(60.9±57.78個 vs 120.4±41.92個和117.6±36.48，p<0.0001)；④熒光顯微鏡和RT-PCR檢測均證實Ezrin蛋白被干擾的穩(wěn)定轉染細胞只存在于原位瘤，而未轉移到肺組織。 結論:

13、 (1)重組質粒pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2均能有效抑制UMR-106骨肉瘤細胞內Ezrin蛋白的表達，以pshRNA1一villin2干擾效果最好。 (2)Ezrin蛋白在細胞的增殖、粘附、運動和侵襲中起重要作用，Ezrin蛋白下調后可使細胞的上述能力減弱，轉移能力降低。 (3)UMR106細胞混懸液原位移植SD大鼠脛骨近端構建的大鼠骨肉瘤模型肺轉移率高，適合于骨肉瘤肺轉移的研究。