1、人乳頭瘤病毒(HPV)是人類多種疾病的致病原，能夠引起包括宮頸上皮在內(nèi)的多種皮膚粘膜上皮的增殖，如宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變、皮膚生殖器疣狀增生和喉乳頭狀瘤病等。皮膚粘膜局部發(fā)生的HPV感染還會促進人類免疫缺陷病毒(HIV)的傳播，因為局部的炎癥會使皮膚產(chǎn)生細小的損傷，并且有淋巴細胞和吞噬細胞浸潤，這都有利于HIV進入機體并感染靶細胞。由HPV持續(xù)感染引起的宮頸癌是死亡率極高的婦女惡性腫瘤，對患者的生理和心理造成了極大的傷害，嚴重危害了

2、人類健康。雖然早期發(fā)現(xiàn)，早期手術并結合化療和放療治療宮頸癌能有效緩解病情，提高患者的五年生存率，但是卻使患者的生活質量大大降低，并且不能最終清除被病毒感染的細胞，防止腫瘤復發(fā)。研究證實具有致癌性的人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是宮頸癌主要病因，95％以上的病例可以由HPV16，18，31，33，45和56型的感染來解釋，而HPV16則是癌組織內(nèi)最常見的一種，檢出率超過50％，因此研制一種有效針對HPV16的疫苗成為防治由HPV16持續(xù)感染導致的

3、宮頸癌的最佳途徑。大量的理論和實驗資料表明，由晚期基因編碼的L1衣殼結構蛋白的C末端數(shù)十個氨基酸殘基對病毒的自組裝是非必須的，去除該區(qū)域后連接上60余個外源氨基酸殘基仍能自行組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。自我組裝形成的VLPs在形態(tài)上與真正的病毒顆粒沒有差別，并且空間構象相似，但不包含病毒性癌基因組，因此可誘導產(chǎn)生有利的體液免疫反應卻沒有潛在的致癌危險性，以此達到預防感染的目的。另一方面，為了有效的清除已經(jīng)感染病毒的細胞，阻止其無限增殖

4、，刺激機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫作用同樣重要。作為細胞免疫反應的主要效應細胞，細胞毒T淋巴細胞(CTL)在病毒感染時通過兩種機制：細胞裂解和細胞凋亡殺傷被感染的細胞，進而在清除病毒和阻止感染慢性化中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，慢性HPV感染者外周血或局部組織中存在特異性CTL，這些CTL可以識別HPV編碼蛋白中一個或多個表位?；蛑亟M或人工合成的HPV蛋白多肽，可在體外刺激CTL，增強其溶解HPV感染的靶細胞。更重要的是，CTL可識別細胞內(nèi)表達

5、的HPV抗原，并對這些表達抗原的細胞有溶解作用。因此，CTL在清除HPV感染中起重要作用。刺激產(chǎn)生CTL的方法很多，其中最常用的是誘導抗原呈遞細胞(APC)表達病毒抗原并與主要組織相容性復合物一同刺激CTLs。大部分HPV相關的腫瘤僅表達E6和E7，因此治療性疫苗的大部分工作都直接針對E6和E7抗原。但是以往的很多研究都是針對E7或E6的全基因片段進行的，但這必然會造成一些變異或可溶性的抗原多肽與CTL的表面受體結合，阻止CTL與被感染

6、的HPV靶細胞發(fā)生反應，或者與表位競爭結合靶細胞表面的MHCⅠ類分子，使CTL不能最大程度地發(fā)揮殺傷功能。因此，如何解決這一問題，成為研制更加有效的治療性疫苗的關鍵。 本實驗對如何產(chǎn)生更加有效的預防和治療性疫苗進行了探索性的研究。首先在以往研究的基礎上，利用L1蛋白在C端缺失數(shù)十個氨基酸仍可自行組裝這一特性，選取其M1-Q471的基因片段為目的基因一。目的基因的模板來源于HPV16標準病毒株pHPV16，采用分段PCR的方法擴增

7、出L1序列的兩部分L1a和L1b，分別以限制性內(nèi)切酶SalⅠ，BamH和XbaⅠ，BamHⅠ雙酶切后逐一插入克隆載體pUC19中，構建出包含L1的克隆質粒pHPV16L1。同時選取能最為有效激活特異性CTL反應的單一表位E749-57的基因片段為目的基因二，并將其連接到片段一的下游區(qū)域，構建融合基因。E749-57的氨基酸序列為RAHYNIVTF，通過人工合成相應的編碼核苷酸序列，并引入合適的酶切位點和翻譯終止信號。將目的基因二與克隆載

8、體pUC19連接后通過藍白斑篩選和測序鑒定確定陽性重組克隆pUC19E7CTL。再將用SalⅠ和XbaⅠ雙酶切獲得的L1序列克隆入pUC19E7CTL中，獲得包含融合基因的重組質粒pHPV16L1/E7CTL，并通過酶切鑒定和測序確定融合基因的核酸序列與GENEBANK中的標準序列相比準確無誤。其次，本實驗選用了利用轉座原理構建的Bacmid-桿狀病毒-昆蟲細胞真核表達系統(tǒng)，這一系統(tǒng)具有操作簡便，費用低廉以及表達準確等優(yōu)點。用SalⅠ和

9、KpnⅠ雙酶切后將上一步驟所得的融合基因L1/E7CTL再一次通過亞克隆的方法插入轉運質粒pFastBacl中，獲得重組pFastBaclHPV16L1/E7CTL。該轉運質粒含有轉座子Tn7，將目的片段轉化感受態(tài)的DH10Bac后，能夠在DH10Bac內(nèi)所含的幫助質粒提供的轉座酶的作用下，定點轉座至線性穿梭質粒Bacmid上miniattTn7位點.轉化后的DH10Bac在涂布含慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Bluo-gal和IPTG的

10、LB平板上培養(yǎng)，通過藍白斑篩選出包含重組桿粒的陽性克隆，獲得重組桿粒BACMIDDNA，并以通用引物M13PCR鑒定插入片段的大小。繼而將純化的重組桿粒與轉染因子Cellfectin混勻，在超凈臺中轉染sf9昆蟲細胞。72小時后觀察細胞形態(tài)，部分細胞出現(xiàn)了典型的感染征象，表明獲得的重組桿粒能夠轉染昆蟲細胞。為下一步實驗進行重組蛋白的表達，研究重組蛋白的免疫活性，生物學活性和空間構象提供了有利條件，為下一步用動物實驗研究此重組蛋白的作用打