1、睪丸支持細胞（Sertoli Cells，SCs）及其結構是由意大利組織學家Enrico Sertoli于1865年首先進行描述的。支持細胞的結構完整性保證了精子發(fā)生的正常進行，在曲細精管中，各級生精細胞鑲嵌在支持細胞上，為生精細胞提供支架。同時，支持細胞能夠分泌類固醇類、激素類、調節(jié)蛋白類、生長因子類、旁分泌因子、轉運蛋白類等為生精細胞分化成熟提供穩(wěn)定的環(huán)境及必須的能量物質，保證精子正常有序的發(fā)生。近年來研究已經證實支持細胞分泌Fas

2、L是其免疫豁免的重要基礎。臨床上，已經利用睪丸支持細胞免疫豁免的功能進行了對人類神經退行性疾病的治療。近年有學者已成功證實將睪丸支持細胞作為飼養(yǎng)層能夠顯著促進多種干細胞的增殖。因此支持細胞已成為細胞培養(yǎng)技術、組織工程及器官移植等領域的研究熱點之一，在臨床移植領域具有廣闊的應用前景。
　　淫羊藿苷（Icariin，ICA）來源于天然植物，是中藥淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim）的主要活性成分，它是一種安

3、全、有效、經濟的天然植物。現(xiàn)代藥理研究表明，ICA能夠促進生殖系統(tǒng)的發(fā)育與成熟、保護心腦血管系統(tǒng)、促進造骨細胞的增殖和分化、提高免疫功能及具有抗癌的作用，然而其部分作用機制尚不明確。所以本研究旨在觀察ICA對SCs體外增殖的影響，并進一步探討ICA可能促進SCs體外增殖的保護作用。故研究SCs體外培養(yǎng)及其增殖具有重要的臨床意義。
　　本實驗分為三部分：
　　第一部分：原代大鼠睪丸支持細胞的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定
　　研

4、究目的：
　　分離培養(yǎng)活力及純度較高的原代睪丸支持細胞（SCs）。
　　研究方法：
　　選取8-9天的SD大鼠，采用兩步酶法分離并進行睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)，48h后，用PH值7.4 Tris-HCL低滲去除污染的間質細胞。用臺盼藍染色檢測細胞的存活力。利用免疫熒光檢測睪丸支持細胞特異性分泌的雄激素結合蛋白（androgen binding protein，ABP）及結晶紫染色觀察細胞形態(tài)進行細胞鑒定。
　　研究

5、結果：
　　通過臺盼藍染色檢測細胞活力和活細胞形態(tài)學彩圖，顯示兩步酶法獲取的睪丸支持細胞的活力達95％以上。經免疫熒光染色及結晶紫染色觀察細胞的形態(tài)，獲取的睪丸支持細胞48h之后純度達到95%以上。
　　研究結論：
　　1、兩步酶法分離培養(yǎng)原代睪丸支持細胞步驟更加簡單，污染的其他生殖細胞數(shù)量更少。
　　2、通過鏡下觀察、結晶紫染色及免疫熒光鑒定，證實兩步酶法獲取的原代睪丸支持細胞純度以及細胞活力均達95%以上。<

6、br>　　第二部分淫羊藿苷對大鼠睪丸支持細胞體外增殖的影響
　　研究目的：
　　用MTT法、流式細胞術、直接細胞計數(shù)方法檢測淫羊藿苷對睪丸支持細胞體外增殖的影響。
　　研究方法：
　　采用MTT法檢測ICA對睪丸支持細胞體外增殖的作用，并確定ICA的有效劑量和作用時間。分別用0μM,5μM,10μM,15μM,20μM及25μM不同濃度ICA對SCs處理24h，以及根據(jù)已確定有效劑量10μM作用于SCs0h,6h

7、,12h,24h及48h不同時間點，采用MTT法，在酶標儀下檢測每孔光密度值來觀察經藥物作用后睪丸支持細胞的活力；為了避免MTT法的不足，我們采用血小板直接計數(shù)不同劑量ICA處理24h后以及10μM處理的不同時間點的48孔板中SCs的數(shù)量，此方法比MTT更加精確，誤差更小，但較MTT繁瑣；為了避免MTT以及直接細胞計數(shù)的誤差，多種檢測方法互相印證，我們又采用熒光標記物CFSE標記培養(yǎng)于六孔板中的SCs，SCs的處理條件同MTT及細胞計數(shù)

8、，然后用流式細胞儀檢測每組細胞的熒光強度，隨著細胞增殖，整合至細胞中的CFSE平均分配于子代細胞中，熒光強度也逐漸減弱，利用這一特點可觀察細胞的增殖能力。
　　研究結果：
　　通過MTT、直接細胞計數(shù)以及熒光強度的檢測，觀察ICA對SCs的增殖的影響，我們發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，ICA5μM組細胞光密度值、細胞數(shù)量及熒光強度無明顯變化（p﹥0.05），ICA10μM,15μM，20μM及25μM各組細胞生長光密度值及細胞數(shù)量明

9、顯增高，熒光強度顯著減弱（p﹤0.05）。ICA10μM處理的SCs隨著時間的延長增殖明顯增加，24h及48h時間點SCs光密度值及細胞數(shù)量明顯增高，熒光強度明顯減弱（p﹤0.05）。
　　研究結論：
　　以上各種方法證明，ICA能夠顯著促進SCs的體外增殖，并且呈現(xiàn)時間及劑量依賴性。
　　第三部分：淫羊藿苷促進大鼠睪丸支持細胞體外增殖的機制研究
　　研究目的：
　　探討淫羊藿苷促進睪丸支持細胞體外增殖作用

10、的機制。
　　研究方法：
　　MAPKs，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是存在于大多數(shù)細胞內的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。其主要作用是將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞相應的生物學反應，如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等。截至目前，在哺乳類細胞已發(fā)現(xiàn)存在著下述三條并行的MAPKs信號通路，即ERK、JNK及p38信號通路，研究證實，ERK信號通路主

11、要參與細胞增殖與分化的調控，而JNK及p38主要參與氧化應激、炎癥與細胞凋亡等的調控。因此在實驗中，我們分別將細胞分為空白對照組、ICA組（只加藥）、UO126組、UO126+ICA、SP600125組、SP600125+ICA、SB203580組及SB203580+ICA組，用以上三種信號通路的特異性阻斷劑，即 ERK阻斷劑 UO126、JNK阻斷劑SP600125、p38的阻斷劑SB203580分別預處理SCs之后加入10μM濃度的

12、ICA作用24h后，用MTT檢測各組細胞的光密度值、細胞計數(shù)及流式細胞儀檢測各組熒光強度。根據(jù)上述實驗結果，選擇對細胞增殖有影響的阻斷劑作用于細胞，處理SCs24h后，提取各組細胞蛋白，用Western blot檢測各組細胞中磷酸化ERK1/2及總ERK1/2的表達水平。
　　研究結果：
　　MTT檢測各組光密度值顯示，與空白對照組相比，ICA組（只加藥）光密度值明顯增加(p﹤0.05)，UO126與UO126+ICA組光密

13、度值顯著低于空白對照組(p﹤0.05)，其余各組與空白對照組之間以及各組之間無明顯差異（p﹥0.05）；直接細胞計數(shù)顯示ICA組（只加藥）細胞數(shù)量明顯高于其他各組(p﹤0.05)，UO126與 UO126+ICA組細胞數(shù)量顯著低于其余各組，SP600125組、SP600125+ICA、SB203580組及SB203580+ICA組與空白對照組之間無明顯差異（p﹥0.05）；流式細胞儀檢測各組熒光強度顯示結果與MTT及細胞計數(shù)結果一致；因

14、此，根據(jù)上述實驗結果我們用Western blot方法檢測p-ERK1/2及ERK1/2的表達水平顯示，p-ERK1/2的表達隨著ICA的劑量增加及時間的延長而增強，加入ERK1/2信號通路的阻斷劑 UO126之后，與空白對照組及 ICA組相比較，只有UO126與 UO126+ICA組p-ERK1/2的表達受到顯著抑制(p﹤0.05)，ICA組p-ERK1/2顯著高于其余各組(p﹤0.05)。
　　研究結論：
　　1、ERK