1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 地錢素C通過ROS介導的DNA損傷促進肺癌細胞凋亡的機制研究
　　一、地錢素C對肺癌的抗腫瘤活性檢測
　　1.地錢素C對肺癌細胞系的抑制作用:我們選用4種肺癌細胞系檢測地錢素C的抑制細胞作用。MTT結果顯示地錢素C對4種肺癌細胞系均顯示出良好的抑制作用，半數(shù)致死量在15μM左右。
　　2.地錢素C對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用:我們通過建立的荷瘤小鼠模型檢測地錢素C的抗腫瘤作用

2、，結果表明地錢素C可顯著抑制腫瘤體積和大小，顯示出良好的抗腫瘤活性。
　　二、地錢素C誘導肺癌細胞凋亡的機制研究
　　1.凋亡相關蛋白的檢測:Western blot結果顯示地錢素C可誘導casepase-3的活化和PARP的剪切，證實了地錢素C誘導肺癌凋亡。時相蛋白的檢測顯示PARP的剪切出現(xiàn)在12h之后，顯示凋亡并非早期事件。
　　2.ROS與DNA損傷的檢測:我們對地錢素C差異表達基因芯片進行pathway分析，

3、發(fā)現(xiàn)地錢素C可以高度影響DNA損傷與修復通路。
　　3.Casepase抑制劑的逆轉效果檢測:Casepase抑制劑zVAD-fmk僅能部分逆轉地錢素C的細胞毒作用，另一方面，地錢素C誘導的肺癌細胞出現(xiàn)胞漿空泡化，這種形態(tài)學變化很難用凋亡來解釋，提示我們除凋亡外還有其他死亡途徑參與其中。
　　第二部分 地錢素C通過抑制蛋白酶體活性和抗微管作用誘導肺癌細胞旁凋亡的機制研究
　　一、自噬與壞死性凋亡在地錢素C誘導肺癌細胞死

4、亡的作用
　　1.自噬在地錢素C誘導肺癌細胞死亡過程中的作用:我們檢測了自噬相關基因及相關通路蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)自噬標志物LC3的表達在1小時即明顯上調(diào)，而后持續(xù)上調(diào)。
　　2.壞死性凋亡在地錢素C誘導肺癌細胞死亡過程中的作用:壞死性凋亡抑制劑Necrostatin對地錢素C誘導的胞漿空泡化和細胞死亡均無逆轉作用，提示我們壞死性凋亡并非地錢素C誘導肺癌細胞死亡的死亡途徑之一。
　　二、地錢素C抑制蛋白酶體活性，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

5、應激
　　1.空泡來源的鑒定:我們選用靶向不同細胞器的熒光探針對其進行標記，激光共聚焦顯微鏡下可清楚地顯示空泡為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源。而透射電鏡下更加清楚地顯示了地錢素C誘導的A549細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，空泡化的過程。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的檢測:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹的最常見原因。我們檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關指標蛋白的表達情況。
　　3.蛋白酶體活性的測定:蛋白酶體功能受抑導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解途徑受阻是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的常見原因。我們發(fā)現(xiàn)盡

6、管地錢素C對蛋白酶體各亞基的表達并無影響，但可顯著抑制肺癌細胞蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性。
　　三、MAPKs不參與地錢素C誘導肺癌細胞旁凋亡
　　我們接下來探討與旁凋亡密切相關的ERK，p38，JNK通路在地錢素C誘導肺癌細胞旁凋亡中的作用。
　　四、LC3在地錢素C誘導肺癌細胞旁凋亡過程中起重要作用
　　LC3的非自噬性上調(diào)是旁凋亡的一個共性。通過聯(lián)用放線菌酮和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的干擾實驗，我們證實MC誘導的持

7、續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是LC3上調(diào)的主要原因，并確定轉錄因子ATF4為這一過程的關鍵分子。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)干擾LC3可顯著逆轉地錢素C誘導的旁凋亡，提示我們LC3在錢素C誘導旁凋亡過程中起重要作用。
　　五、地錢素C的抗微管作用在誘導肺癌細胞旁凋亡的過程中起重要作用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染實驗證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激產(chǎn)生的膜泡并未運輸至溶酶體降解，而芯片結果顯示地錢素C可顯著抑制兩種微管蛋白的表達。
　　第三部分 地錢素C通過調(diào)控RG

8、S4表達抑制非小細胞肺癌侵襲轉移的機制研究
　　一、地錢素C抑制A549細胞侵襲轉移
　　Transwell體外侵襲實驗表明地錢素C可顯著減少肺癌細胞侵襲至下室的細胞數(shù)目。而劃痕實驗則顯示地錢素C可顯著延緩劃痕愈合的進度，以上實驗說明地錢素C誘導肺癌細胞死亡的同時亦可顯著抑制其侵襲轉移的能力。
　　二、地錢素C上調(diào)RGS4表達
　　1.地錢素C對CXCR4與EGFR表達無影響:為探明地錢素C抑制肺癌細胞侵襲轉移的

9、機制，我們首先檢測了介導肺癌侵襲轉移的主要膜受體CXCR4與EGFR的表達。結果顯示地錢素C對2種受體的表達并無影響。
　　2.RGS4在肺癌細胞系中低表達:因CXCR4與EGFR的激活均依賴于G蛋白，我們接下來關注可以負調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體的RGS家族。
　　3.地錢素C可顯著上調(diào)RGS4的表達:我們選取了RGS4低表達的A549細胞系進行研究，結果顯示盡管地錢素C對RGS4的mRNA表達水平無明顯影響，但可顯著上調(diào)RGS4

10、蛋白的表達。
　　三、過表達RGS4可下調(diào)MMPs，并逆轉EMT，顯著抑制A549細胞侵襲轉移
　　1.過表達RGS4可顯著抑制A549細胞的侵襲轉移能力:我們將pcDNA3.1-RGS4轉入A549細胞過表達RGS4，劃痕實驗和transwell侵襲實驗顯示過表達RGS4可顯著抑制A549細胞的轉移能力和侵襲能力。
　　2.過表達RGS4可下調(diào)MMPs并逆轉EMT:我們運用pcDNA3.1-RGS4轉染A549細胞后

11、檢測MMP蛋白與EMT相關指標蛋白的表達變化，結果顯示過表達RGS4可顯著下調(diào)A549細胞中MMP2與MMP9的表達;另一方面，E-cadherin表達下調(diào)，Vimentin表達下調(diào)。說明RGS4可通過抑制MMPs，逆轉EMT，從而抑制A549細胞侵襲轉移。
　　3.過表達RGS4可阻斷EGFR和CXCR4介導的侵襲轉移能力增加:我們將pcDNA3.1-RGS4轉入A549細胞過表達RGS4，transwell侵襲實驗顯示過表達R

12、GS4可完全逆轉CXCR4介導的侵襲轉移能力增加，可部分逆轉EGFR介導的侵襲轉移能力增加，這提示我們CXCR4作為G蛋白偶聯(lián)受體，可直接被RGS4負調(diào)控。
　　四、地錢素C通過RGS4抑制肺癌細胞侵襲轉移
　　Transwell體外侵襲實驗和劃痕實驗顯示干擾RGS4可以完全逆轉地錢素C對肺癌細胞侵襲轉移的抑制效果。同時western blot結果顯示干擾RGS4亦可以阻斷MMP2/9的下調(diào)及EMT的逆轉，因此，我們得出結論

13、:地錢素C通過上調(diào)RGS4抑制肺癌細胞侵襲轉移。
　　第四部分 RGS4表達與非小細胞肺癌患者預后的相關性研究
　　我們在第三部分中發(fā)現(xiàn)RGS4在肺癌細胞系與肺正常細胞系之間存在明顯的表達差異，而后續(xù)實驗又證實了RGS4的表達與肺癌細胞侵襲轉移能力相關。
　　一、RGS4在肺癌組織中低表達
　　我們運用免疫組化對121例非小細胞肺癌腫瘤組織切片與67例癌旁組織切片中的RGS4表達進行分析。結果顯示:41.3％(5

14、0/121)的腫瘤組織中RGS4高表達，與之相對的，高達64.2％(43/67)的癌旁組織中RGS4高表達。
　　二、RGS4表達與臨床病理指標的相關性分析
　　我們統(tǒng)計了121例非小細胞肺癌患者腫瘤組織切片中RGS4的表達情況及相關臨床病理指標并建立數(shù)據(jù)庫，運用卡方檢驗檢測RGS4表達與臨床病理指標之間的相關性。結果顯示RGS4表達與淋巴結轉移(P=0.009)、TNM分期（P=0.008）顯著相關。再次印證RGS4與腫瘤

15、侵襲轉移的相關性。
　　三、RGS4表達與非小細胞肺癌患者預后的相關性分析
　　1.RGS4表達與非小細胞肺癌患者5年無病生存率的相關性分析:我們運用Log-rank檢驗比較患者生存差別，Cox回歸多因素分析判斷預后因素是否獨立，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。結果顯示RGS4低表達患者其5年無病生存率顯著低于RGS4高表達患者(P=0.002)，多因素分析顯示RGS4是判定患者5年無病生存率的獨立因素(P=0.02

16、0)。
　　2.RGS4表達與非小細胞肺癌患者5年總生存率的相關性分析:我們運用Log-rank檢驗比較患者生存差別，Cox回歸多因素分析判斷預后因素是否獨立，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。結果顯示RGS4低表達患者其5年總生存率顯著低于RGS4高表達患者(P=0.005)，多因素分析顯示RGS4是判定患者5年總生存率的獨立因素（P=0.041）。
　　第五部分結論及創(chuàng)新點
　　一、結論
　　1.地錢素

17、C在體內(nèi)和體外均顯示良好的抗腫瘤活性。
　　2.地錢素C通過誘導ROS聚積和DNA損傷引發(fā)肺癌細胞凋亡。
　　3.地錢素C通過抑制蛋白酶體活性及抗微管作用誘導肺癌細胞旁凋亡。
　　4.地錢素C通過調(diào)控RGS4表達抑制肺癌細胞侵襲轉移。
　　5.RGS4在非小細胞肺癌中低表達，可作為一個獨立的負相關因素評價非小細胞肺癌的預后
　　二、創(chuàng)新點與不足之處
　　1.首次報道地錢素C誘導的細胞凋亡與ROS聚積和