1、該實驗采用原位膠原酶灌注法和梯度密度離心法,從SD大鼠肝臟分離HSC.培養(yǎng)10—14天后傳代,貼片法及ABC法作免疫組織化學染色鑒定,大鼠結蛋白(Desmin)表達陽性率純度為95％以上,平滑肌肌動蛋白α-SMA則幾達100％.由于脂多糖比較全面的激活能力,能夠以依賴和不依賴NO的方式激活HSC,傳代的HSC給予低血清(5％胎牛血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時,使其靜止后,分別采用終濃度為1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL的脂多糖刺

2、激HSC,MTT法檢測其生存能力.為了解MLT誘導HSC凋亡是否與caspase有關,利用酶特異的可見光底物DEVD-pNA與caspase3作用后顯色的原理,用分光光度計檢測各組細胞吸光度.HSCs激活、增殖,往往伴隨著NF-κB的持續(xù)升高.最近對HSC的研究表明,NF-κB是保護性因素,抑制細胞的凋亡.我們采用Western blot檢測MLT對NF-κBp65的表達影響,結果,小劑量LPS的刺激下,HSCs激活、增殖,檢測出高表達

3、的NF-κB,0.1mmol/L的MLT顯著的抑制了NF-κB的表達,P<0.01.氧化應激是肝損傷和肝纖維化之間的重要關聯(lián),氧化應激可通過誘導NF-κB活性,在HSC的激活中起重要作用.該實驗采用熒光分光光度計檢測DCFH-DA轉化為DCF的熒光強度,代表細胞內ROS水平.該實驗還采用放射免疫法檢測細胞內cAMP濃度,免疫熒光度法檢測細胞內鈣離子濃度.結果發(fā)現(xiàn),預先給予0.1mmol/LMLT組細胞內cAMP水平和鈣離子濃度顯著低于對