1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是目前世界上用途最廣、產量最大的微生物殺蟲劑，在世界范圍內得到廣泛的應用。編碼Bt殺蟲蛋白的基因也作為最主要的殺蟲基因轉入到了多種重要的糧棉作物中，在害蟲防治中起著巨大的作用。但目前轉基因Bt農作物和Bt制劑的使用正面臨著致命的威脅，即害蟲對Bt的抗藥性。Bt毒素合理、有效的應用引起了全世界的關注和討論。蛋白轉導結構域(PTD-ProteinTransductionDom

2、ain)是一類能自動穿透細胞膜，并能作為載體將其它生物大分子攜帶進入細胞膜內的一段富含精氨酸的多肽。近年來PTD在醫(yī)學上的應用研究得到了空前的發(fā)展，其轉導特性已成功地應用于多種疾病的臨床治療研究。 本研究通過PTD與Bt殺蟲蛋白Cry1Ac融合表達載體的構建、融合蛋白的表達純化、生物活性測定和免疫檢測，證明了PTD增強了Bt殺蟲蛋白Cry1Ac的殺蟲活性。主要結果如下： 1.按照6His-TAT-Cry1Ac-6His和

3、6His-Cry1Ac-6His的順序，合成6個組氨酸、11個氨基酸TATPTD，成功設計構建了適合原核表達的四種PTD-Cry1Ac融合表達載體，即pET-1AC載體(含有pET-21b+Cry1Ac功能片段基因，簡稱P)、pET-T1AC載體(含有pET-21b+TAT肽+Cry1Ac功能片段基因，簡稱T)、pET-PQ1AC載體(含有pET-21b+部分Cry1Ac功能片段基因，簡稱PQ)、和pET-TQ1AC載體(含有pET-2

4、1b+TAT肽+部分Cry1Ac功能片段基因，簡稱TQ)。經測序分析，與實驗設計完全一致，表明獲得相應融合表達載體。 2.對構建的融合表達載體進行誘導、表達。在20℃，116rpm，振蕩培養(yǎng)26h，IPTG濃度為0.1mol/ml條件下進行誘導，使表達的蛋白在上清大大多于沉淀，得到可溶性融合蛋白。這為純化提供了極大的便利條件。 3.融合表達蛋白以小菜蛾室內種群和上海田間種群進行生物測定。生測實驗結果如下：對小菜蛾室內種群

5、，加TAT肽的融合蛋白pET-T1AC(T)的LC50為60.20μg/ml，而pET-1AC(P)蛋白LC50為80.82μg/ml，增效倍數(shù)為1.34倍；同樣，加TAT肽的融合蛋白pET-TQ1AC(TO)的LC50為100.70μg/ml，而pET-PQ1AC(PQ)蛋白LC50為116.67μg/ml，增效倍數(shù)為1.16倍。對小菜蛾上海田間種群，加TAT肽的融合蛋白pET-TQ1AC(TQ)的LC50為20.51μg/ml，而p

6、ET-PQ1AC(PQ)蛋白LC50為97.60μg/ml，增效倍數(shù)為4.76倍，表明PTD對Bt毒素Cry1Ac殺蟲蛋白具有一定的增效作用。 4.四種融合蛋白進行純化。純化的蛋白與兩個小菜蛾室內種群的BBMV(BrushBorderMembraneVesicles)進行ELISA免疫檢測，結果表明：在BBMV中加入T和TQ蛋白分別比加入P和PQ蛋白的吸光值要大，說明T和TQ蛋白分別比P和PQ蛋白與小菜蛾BBMV結合性要強。同時