1、銀屑病是一種常見的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病,給患者的身心帶來極大的痛苦,嚴重影響著患者的生活質量。在銀屑病的治療方面,維生素D3類似物、維A酸的出現(xiàn)都起到了革命性的作用。目前維生素D3類似物為美國及歐洲的輕、中度銀屑病的第一外用藥,外用第三代維A酸治療尋常型銀屑病也已逐漸被推廣。目前維生素D3類似物及維A酸兩類藥物用于治療銀屑病的作用機制仍在研究之中。國內外臨床治療銀屑病的過程中,聯(lián)合應用維生素D3類似物和維A酸類藥物,能起到降低藥物使用

2、濃度及副作用而增強療效的作用。由此,在蛋白質水平上,研究維生素D3類似物、維A酸以及該兩類藥物的聯(lián)合應用對KC的影響,可為該兩類藥物的作用機制及其臨床聯(lián)合應用提供更多的理論依據(jù)。 本研究應用差異蛋白質組學的方法,通過對HaCaT細胞及其藥物誘導后細胞全蛋白的分析比較,研究骨化三醇、芳維A酸氨丁三醇及兩藥聯(lián)合應用對KC蛋白質表達的影響,尋找維生素D3類似物及其聯(lián)合芳維A酸氨丁三醇作用機制的相關靶蛋白,從而為銀屑病的治療,尤其骨化三

3、醇聯(lián)合維A酸治療,提供理論依據(jù)。 第一部分 HaCaT細胞的培養(yǎng)、藥物干預及蛋白質樣品的制備 目的：人表皮KC(HaCaT 細胞系)的培養(yǎng)、藥物誘導,以及細胞全蛋白的提取,為后續(xù)的蛋白質組學分析提供基礎。 方法:HaCaT細胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代,待細胞生長至約80％融合,改用無血清的K-CSF培養(yǎng)24小時后,分別加入新鮮配制的10-8mol/L的骨化三醇、10-7mol/L的AT及兩藥同時加入,陰性對照組加等量的無血

4、清K-CSF,每種條件設置3個復孔,避光培養(yǎng)48小時后收集陰性對照組及各加藥組細胞,采用反復凍融法提取細胞全蛋白,用Bradford法測定蛋白濃度,蛋白樣品分裝,置-80℃保存。 結果： 1.采用含9M尿素、4％(W/V)CHAPS等的細胞裂解液,-80℃冰箱反復凍融3-4次,四組細胞提取的全蛋白的濃度較高。 2.骨化三醇與AT對HaCaT細胞蛋白質的表達的影響無統(tǒng)計學差別；骨化三醇及AT與陰性對照相比無統(tǒng)計學差

5、異；兩藥聯(lián)合應用可明顯降低細胞的蛋白質表達,與陰性對照及兩者單獨作用時的蛋白質濃度相比較,均有統(tǒng)計學意義。 結論：骨化三醇和AT聯(lián)合作用時其抑制蛋白質表達的功能強于任一藥物的單獨作用。 第二部分 HaCaT細胞全蛋白的2-DE圖譜的建立 目的：建立適用于HaCaT細胞的分辨率高和重復性好的2-DE平臺,并使用該平臺對實驗第一部分得到的蛋白樣品進行二維電泳,得到各組蛋白質二維分離的凝膠圖譜。 方法：以固相p

6、H梯度等電聚焦為第一向和垂直SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳為第二向,按照Bio-Rad 2-DE的流程摸索出適用于HaCaT細胞全蛋白的水化上樣緩沖液濃度、等電聚焦(IE F)電泳程序、高效的二向分離膠凝濃度等條件。然后在同樣條件下對前期制備的蛋白質樣品進行固相pH梯度2-DE分離、銀染,并圖像掃描。 結果：采用長17cm、pH 3-10,非線性NL預制膠條,濃度為12％的分離膠,增加上樣緩沖液中DTT的含量,等電聚焦升壓順利,所得

7、圖像縱紋、橫紋少,蛋白點清晰,無明顯脫尾等現(xiàn)象。 結論：本研究成功建立了HaCaT細胞全蛋白的2-DE展示平臺,建立了圖像清晰、分辨率高和重復性好的固相PH梯度2-DE圖譜,得到了較好的蛋白質分離及展示效果。 第三部分凝膠圖像的分析和差異蛋白質的質譜鑒定 目的：尋找陰性對照、骨化三醇、AT及聯(lián)合用藥四組KC蛋白質表達的差異,揭示骨化三醇、AT藥物作用后蛋白表達的質與量上與正常角質細胞的差異。通過質譜分析為差異的蛋

8、白質定性,從而揭示藥物作用機制中的靶蛋白。 方法：使用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對2-DE圖譜進行匹配分析,并以同實驗條件下的建立的正常角質細胞的2-DE圖譜及人類正常角質細胞2-DE數(shù)據(jù)庫中的結果作為參照,篩選出存在差異的蛋白質點。切取符合質譜分析濃度要求的10個差異蛋白質點,進行膠內酶解,后通過基質輔助激光解吸附飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對蛋白質點進行氨基酸序列分析,依據(jù)酶解肽片

9、斷的質量,通過Mascot軟件查詢SWISS-PROT蛋白數(shù)據(jù)庫,經(jīng)軟件自動運算得出Mascot得分,確定出被測蛋白質的可能屬性及名稱。 結果： 1、建立了一個包含3000余個蛋白質點的KC的雙向電泳圖譜。四組細胞的3塊凝膠的平均蛋白質點數(shù)分別為3143±284、3081±404、2930±729、3222±526。 2、同一組細胞的同一蛋白點在3塊膠的重復性好,其變異程度的平均值為0.2552。 3、四

10、組數(shù)據(jù)間兩兩比較分析不同藥物作用后的雙向凝膠電泳圖譜,差別1.1倍以上的蛋白質點數(shù)分別有10-38個,其中聯(lián)合用藥組與骨化三醇組以及骨化三醇組和AT組間的差異點較多。 4、送檢10個蛋白質,檢測出4個,分別為:Serpin B1,IRF4的irf結構域立體結構的A鏈,fascin homolog1,還有一種由1081個氨基酸組成的未命名的蛋白質。 結論：使用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對凝較