1、本研究分為三部分： 第一部分：鞘內注射利多卡因對慢性坐骨神經壓迫模型大鼠神經病理性疼痛的治療作用 目的：采取主動性鞘內注射大劑量的利多卡因，可治愈頑固性、難治性疼痛。但目前，此方法仍存在很多尚未明確的問題，如治療時藥物的最佳劑量，其療效維持時間等。本課題擬應用慢性坐骨神經壓迫損傷大鼠模型(Chronicconstrictioninjury，CCI)，比較不同劑量利多卡因對慢性壓迫性損傷模型大鼠的熱痛敏和觸覺異常疼痛的作用

2、，確定有效藥物劑量范圍，治療后的療效及疼痛緩解時間，探討鞘內注射利多卡因療法的最佳模式和治療效應，為其在臨床上的安全應用提供參考. 方法：健康清潔級成年雄性SD大鼠，隨機分為10組：其中8組大鼠均接受CCI手術，在CCI手術后7天，分別接受鞘內注射0.9％生理鹽水(saline組)，或不同濃度的利多卡因注射組(2，4，6.5，10，15，25，和35mg/kg)。正常組和正常對照組不行CCI手術，其中一組接受鞘內25mg/kg利

3、多卡因注射。觀察各組術前(baseline)，CCI術后(CCI1天，3天，6天)，鞘內注射利多卡因(Singleintrathecallidocaine，SIL)1天，2天...10天的觸覺縮爪閾值(VonFreywithdrawalthreshold，PWT)和熱潛伏縮爪閾值(ThermalPawWithdrawallatency，PWL)改變。正常組和正常對照組行FJB染色。術中記錄其血壓、心率、呼吸等指標的變化。 結果：

4、大鼠CCI術后6天PWT和PWL明顯下降，接受鞘內注射利多卡因后，6.5mg-35mg組熱痛敏異常明顯緩解，并呈現(xiàn)劑量相關，可持續(xù)2-8天，但是2mg和4mg組沒有明顯效果。15，25，35mg/kg組可以明顯減輕CCI大鼠的觸覺異常疼痛。正常組和正常對照組的PWT和PWL以及FJB染色沒有差異。 結論：鞘內注射利多卡因可以明顯抑制大鼠由CCI手術所引起的神經痛，考慮到利多卡因的有效性以及不良反應，最佳有效劑量應為15-25mg

5、/kg。 第二部分：抑制小膠質細胞p38MAPK磷酸化是鞘內注射利多卡因治療CCI大鼠神經病理性疼痛的重要機制 目的：第一部分實驗發(fā)現(xiàn)，鞘內注射15-25mg/kg利多卡因可以明顯抑制大鼠CCI手術所引起的神經痛，但其機制尚不明確。目前，在多種疼痛模型上發(fā)現(xiàn)，神經損傷后脊髓的小膠質細胞磷酸化p38有絲分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase；p38MAPK)免疫反應陽性成分明

6、顯增加，而鞘內給予p38MAPK抑制劑可以減輕傷害感受性行為學變化。這些研究均提示了脊髓小膠質細胞p38MAPK在痛覺過敏的產生過程中發(fā)揮重要作用。本研究應用免疫熒光和蛋白免疫印跡技術法研究鞘內注射利多卡因與脊髓小膠質細胞的p38MAPK信號通路之間的關系。 方法：健康清潔級成年雄性SD大鼠.隨機分為4組：Norm組(正常大鼠)，CCⅠ組(單純行CCI神經痛手術)，CCI+0.9％NaCl組(CCI后7天，鞘內注射0.5ml0.

7、9％NaCl)，CCI+25mg/kg利多卡因組(CCI后7天，鞘內注射0.5ml25mg/kg利多卡因).①對CCI神經痛模型大鼠LA-5脊髓冰凍切片行免疫熒光染色，將磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)抗體與小膠質細胞特異標記物OX42抗體，或神經元特異標記物NeuN抗體，或星型膠質細胞特異標記物GFAP抗體共標，觀察p-p38MAPK在CCI神經痛模型的大鼠脊髓各種細胞上的表達情況。應用蛋白免疫印跡技術，觀察CCI術后大鼠L

8、4-5脊髓p-p38MAPK蛋白表達的變化。②鞘內注射利多卡因術后4天，用免疫熒光染色方法和蛋白免疫印跡技術觀察各組大鼠p-p38MAPK蛋白表達情況. 結果：①CCI神經痛模型可引起大鼠L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白表達明顯增加；p-p38MAPK抗體與小膠質細胞特異標記物OX42，神經元特異標記物NeuN，或星型膠質細胞特異標記物GFAP共標結果顯示，p-p38MAPK和OX42共定位良好，說明坐骨神經壓迫性損傷手術引起

9、L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白特異地表達于小膠質細胞。②免疫熒光法和蛋白免疫印跡技術法均證明鞘內注射25mg/Kg利多卡因可明顯抑制大鼠L4-5脊髓小膠質細胞上p-p38MAPK表達。 結論：本實驗結果揭示，在CCI手術后，大鼠L4-5脊髓的p-p38MAPK蛋白表達明顯增加，p-p38MAPK僅特異地表達于脊髓的小膠質細胞上。鞘內注射利多卡因25mg/kg可以明顯抑制大鼠CCI神經痛模型所引起的觸覺異常疼痛，部分機制可能是

10、由于抑制了L4-5脊髓小膠質細胞p-p38MAPK表達。 第三部分利多卡因抑制ATP誘導的大鼠小膠質細胞分泌TNF-α，IL-1β和IL-6 目的：第二部分研究發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞內表達的p38MAPK在CCI神經損傷模型導致的神經痛中扮演重要的角色。而鞘內注射利多卡因可抑制小膠質細胞內p38MAPK的激活。本研究應用ELISA，蛋白免疫印跡技術法和RealtimePCR等方法研究利多卡因對ATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內

11、鈣離子，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的影響，并了解其和小膠質細胞的p38MAPK信號通路之間的關系。 方法：原代培養(yǎng)大鼠小膠質細胞，隨機分為5組：Control組，1mMATP組，1mMATP+0.1mMLidocaine組，1mMATP+1mMLidocaine組，1mMATP+10mMLidocaine組。①用蛋白免疫印跡技術法觀察，不同濃度利多卡因對1mMATP誘導的原代培養(yǎng)

12、的小膠質細胞p-p38MAPK的表達情況。②用RealtimePCR的方法，觀察不同濃度利多卡因對1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA水平變化情況。③用ELISA方法觀察不同濃度利多卡因對1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內TNF-α，IL-1β和IL-6蛋白水平變化情況。④用單細胞鈣成像法觀察不同濃度利多卡因對1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內鈣變化的影響。⑤用MTT方法了解不同濃

13、度利多卡因對原代培養(yǎng)的小膠質細胞活力影響。 結果：①蛋白免疫印跡實驗結果發(fā)現(xiàn)，10mM利多卡因可明顯抑制1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞p-p38MAPK的表達(P＜0.05)。②RealtimePCR結果顯示利多卡因可明顯抑制1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA水平，呈濃度依賴性，10mM利多卡因最為明顯(分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)。③ELISA結果發(fā)現(xiàn)利

14、多卡因可明顯抑制1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內TNF-α，IL-1β和IL-6蛋白水平表達，呈濃度依賴性，10mM利多卡因最為明顯(分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。④單細胞鈣成像結果顯示10mM利多卡因可以明顯抑制對1mMATP誘導的原代培養(yǎng)的小膠質細胞內鈣增加(P＜0.05)。⑤MTT結果發(fā)現(xiàn)本實驗濃度的利多卡因對原代培養(yǎng)的小膠質細胞活力無影響. 結論：本實驗結果顯示，利多卡因可以抑制ATP誘導的大