1、背景：心房顫動（簡稱房顫）是一類臨床常見的心律失常性疾病，影響了至少420萬中國人的健康。由于人口老齡化及醫(yī)療水平的提高，房顫的患病率在未來的20年預期會增加一倍。房顫帶來的巨大醫(yī)療財政負擔、增高的人群死亡率以及以腦卒中、心力衰竭為主的致死性臨床事件要求我們進一步完善對其發(fā)病機制的認識。然而房顫模型建立所需的設備和技術要求使得相關研究的廣泛開展受到限制，因而我們對房顫病理過程中相關分子生物學機制的認識相對滯后。既往的臨床研究表明房顫患者

2、心房肌出現(xiàn)加劇的細胞凋亡和組織纖維化，且其嚴重程度和房顫的發(fā)展、轉歸成正相關，提示細胞凋亡和纖維化是房顫藥物治療的潛在靶點，與抗心律失常藥物聯(lián)用可以增強療效、減輕毒副作用。內質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress，ER stress)是一種進化保守的細胞適應性反應。在炎癥、缺氧等不良環(huán)境下，ER stress可以通過啟動未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)促進細胞生存;

3、當刺激因子持續(xù)存在，ER stress過度激活，ER stress相關的凋亡通路將會啟動以清除功能受損的細胞，同時造成組織損傷。ER stress凋亡通路涉及的調控因子眾多，如鈣離子、蛋白酶、激酶、轉錄因子、自噬等，它們彼此間的調控關系被充分認識的卻很少。尤其是針對房顫病程中ER stress對細胞凋亡的生物學作用及具體機制的研究還鮮有報道。除了對蛋白質轉錄翻譯及細胞凋亡的調控外，近年來科研人員還發(fā)現(xiàn)ER stress似與膠原沉積、纖維

4、化形成也有著一定關聯(lián)。Baek HA報道轉化生長因子β2(Transforming growth factor-beta2，TGF-β2)可以誘導ER stress發(fā)生，同時伴成纖維細胞α平滑肌肌動蛋白表達增多，預示著成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型轉換。而在同時給予ER stress抑制劑4-PBA后，TGF-β2對成纖維細胞表型轉換的誘導作用被抑制。其中成纖維細胞向肌成纖維細胞的演變是組織纖維化形成的早期改變。綜上所述，ER stre

5、ss很可能是房顫患者心房肌細胞凋亡和心房組織纖維化的重要調控因子，是延緩心房器質性病變的潛在靶點，然而其具體的生物學作用及相關調控機制，還需要我們進一步深入研究。
　　目的：⑴高頻電刺激小鼠心房來源的HL-1細胞系建立房顫的體外模型，驗證其是否具有與房顫患者心房肌一致的電學和結構重構，為房顫的研究提供確實可靠的研究載體。⑵驗證高頻電刺激后HL-細胞是否發(fā)生細胞凋亡和膠原代謝異常。⑶探索ER stress對高頻電刺激后HL-1細胞凋

6、亡及膠原代謝的生物學作用及調控機制，以期從分子生物學角度完善對房顫病理生理機制的認識。
　　方法：①將5ms脈寬，10V/cm電壓，且同時選擇4Hz與8Hz兩種頻率的高頻電刺激作用于HL-1細胞24 h。以膜片鉗技術檢測對照組、4Hz組及8Hz組的動作電位時程，調定后續(xù)的刺激頻率參數(shù)。②利用膜片鉗、透射電鏡、激光共聚焦顯微鏡及Western Blot分別檢測HL-1細胞動作電位時程(Action potential duratio

7、n，APD)、形態(tài)學、細胞內游離鈣、離子通道和膠原等的蛋白表達，驗證其是否具有與房顫時心房肌一致的電學和組織學改變。③HL-1細胞接受不同的藥物預處理，包括ER stress的抑制劑、線粒體凋亡通路(Mitochondria apoptotic pathway，MAP)的抑制劑和絲裂原活化的蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的抑制劑。利用CellCounting Kit、Hoe

8、chst和AnnexinⅤ/PI染色、JC-1染色和Western Blot分別檢測細胞活力、細胞凋亡、線粒體膜電位和信號通路蛋白表達，以探索ERstress、MAP和MAPKs在高頻電刺激所致細胞凋亡中的生物學作用及三者間的交互調控機制。④HL-1細胞接受不同的藥物預處理，包括ER stress的抑制劑或激動劑及鈣蛋白酶(Calpain)抑制劑，利用Western Blot檢測信號通路蛋白表達，以探索ER stress、Calpain

9、和TGF-β2通路在高頻電刺激所致的膠原代謝異常中生物學作用和相互調控機制。
　　結果：⑴對照組、4Hz組和8Hz組的APD90分別是159.3±4.910ms、129.7±4.631ms和74.00±3.606ms。8Hz刺激頻率為房顫時的心房的顫動頻率(350-600)，且造成更明顯的APD90下降，被選用做后續(xù)實驗的頻率參數(shù)。⑵高頻電刺激24 h引發(fā)HL-1細胞出現(xiàn)APD縮短，形態(tài)學改變（細胞膜完整性破壞，偽足形成、細胞核固

10、縮變形及細胞器腫脹），細胞內鈣離子超載，快速激活的延遲性整流鉀通道、L型鈣通道和縫隙連接蛋白43蛋白表達下調，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達上調。⑶高頻電刺激24h誘導44.23±2.69％的細胞發(fā)生凋亡，而對照組凋亡率僅為1.84±0.25％。在高頻電刺激2h前預先給予ER stress抑制劑降低細胞凋亡率至23.70±2.91％;預先給予MAP抑制劑降低細胞凋亡率至18.59±6.58％;預先給予MAPKs各成分的抑制劑，可以將凋亡率降至2

11、0％-25％不等。⑷高頻電刺激24 h破壞線粒體功能，降低線粒體膜電位，在高頻電刺激2h前預先給予ER stress和MAPKs的抑制劑可以不同程度緩解高頻電刺激引發(fā)的線粒體膜電位降低。⑸高頻電刺激24h上調ER stress、MAP和MAPKs的蛋白表達，在高頻電刺激2h前預先給予ER stress抑制劑可以一定程度的緩解高頻電刺激造成的MAP和MAPKs激活。⑹高頻電刺激24 h上調膠原、基質金屬蛋白酶、TGF-β2通路和Calpa

12、in的蛋白表達。在高頻電刺激2h前預先給予ER stress或Calpain抑制劑可以一定程度的緩解高頻電刺激導致的膠原代謝異常。⑺ER stress的激動劑可以上調Calpain、膠原、基質金屬蛋白酶和TGF-β2通路的蛋白表達。而抑制Calpain功能后，ER stress激動劑造成的膠原代謝紊亂被糾正。
　　結論：①高頻電刺激后的HL-1細胞是房顫確實可靠的體外模型。②高頻電刺激誘導HL-1細胞發(fā)生細胞凋亡和膠原代謝紊亂。③