1、多不飽和脂肪酸(PUFA)可分為ω-3和ω-6系列脂肪酸在體內具有廣泛的生理功能和生物學效應。人體ω-3和ω-6PUFA的比例失衡可以引起一些疾病和生理機能失調。線蟲fat-1基因表達的ω-3脂肪酸去飽和酶可以將ω-6PUFA轉化為ω-3PUFA，具有重要的醫(yī)學和營養(yǎng)學價值。本課題擬用分子生物學技術構建原核表達載體，使線蟲fat-1基因在大腸桿菌中表達，并對該表達產物的酶學活性做初步的探討，為進一步開展ω-3脂肪酸去飽和酶的體外酶學研究

2、奠定基礎。 [方法]擴增純化含有線蟲fat-1基因的pUC18質粒和原核表達載體pET32a(+)。采用雙酶切插入的方法，構建fat-1基因的原核定向表達載體pET32a-fat-1，并采用酶切試驗和DNA測序分析鑒定重組結果。用經過鑒定的pET32a-fat-1轉化大腸桿菌DE3，采用RT-PCR方法檢測fat-1基因在大腸桿菌DE3中的轉錄活性；以ω-6PUFA為底物培養(yǎng)含有重組質粒的大腸桿菌DE3，采用IPTG誘導fat-

3、1基因的表達，并采用氣相色譜質譜法分析大腸桿菌中脂肪酸的組分及其含量變化，從而分析檢測表達的ω-3脂肪酸去飽和酶活性。 [結果] (1)將擴增菌DH5a中的重組質粒pET32a-fat-1抽提和純化后，酶切鑒定和DNA測序的結果表明，構建的fat-1基因原核表達載體pET32a-fat-1與理論值相符； (2)將純化的重組質粒轉化大腸桿菌DE3表達菌株，RT-PCR半定量分析測定結果顯示，在大腸桿菌DE3中的重組

4、質粒pET32a-fat-1可以轉錄出fat-1的mRNA，并且轉錄活性隨IPTG誘導濃度的改變而改變； (3)采用氣相色譜質譜法分析的結果顯示，以ω-6PUFA為底物培養(yǎng)含有重組質粒的大腸桿菌DE3，經IPTG誘導后，大腸桿菌中有ω-3PUFA的產生，并且ω-3PUFA的含量隨著IPTG誘導時間、培養(yǎng)溫度和底物ω-6PUFA的不同而不同。 [結論]通過雙酶切定向克隆的方法成功構建了fat-1基因的原核定向表達載體pET