1、水稻是我國最主要的糧食作物之一,主要起源于熱帶和亞熱帶地區(qū),其地理分布主要受溫度的影響。不飽和脂肪酸是植物膜系統(tǒng)的重要組份之一,它在低溫條件下維持細胞功能和保護植物體方面起到重要的作用。因此,采用遺傳工程方法增加不飽和脂肪酸含量對培育水稻耐低溫育種的研究意義重大,刻不容緩。
　　本論文中采用RT-PCR的方法從水稻Dryza sativa L.葉片中克隆到編碼水稻內質網ω-6脂肪酸去飽和酶基因的開放閱讀框(ORF),全長1167b

2、p,包含388個氨基酸,命名為OsFAD2(登錄號:No.FJ768953)。BLAST檢索顯示它與其它物種內質網ω-6脂肪酸去飽和酶基因(FAD2)具有較高同源性,氨基酸序列比對發(fā)現其包含膜結合蛋白所特有的三個保守的組氨酸簇,在C末端存在著內質網定位所必須的(-YNNKL)序列導肽,聚類分析顯示該基因屬于組成型表達FAD2基因。
　　水稻OsFAD2為組成型表達基因,該基因在葉片中的表達量明顯高于其它器官。原位檢測結果表明:在根

3、中,在黑暗和冷脅迫條件下,OsFAD2的表達與對照相比在各個組織中分布無明顯變化;在葉中,黑暗處理條件下,OsFAD2在葉肉細胞和維管束組織中的表達量有所下調,而冷脅迫條件下OsFAD2的mRNA主要在表皮細胞中積累。Real-time PCR結果顯示:受到在不同激素處理之后,OsFAD2基因的表達量上升。
　　構建酵母真核表達載體pYES NT(C)-OsFAD2,經醋酸鋰法轉化釀酒酵母INVSc1,通過缺尿嘧啶培養(yǎng)基篩選獲得多

4、拷貝陽性克隆菌株。Western blot結果表明同源重組的酵母能正常表達含有目的基因的融合蛋白,同源重組酵母在4℃低溫下的菌落生長狀況明顯好于空載轉化酵母,表明OsFAD2基因的轉入提高了酵母對低溫的耐受性。構建蛙卵表達載體pT7TS-OsFAD2,采用顯微注射的方法轉入蛙卵細胞中,外源施加油酸2h之后,可以監(jiān)測到亞油酸的生成。
　　構建重組植物表達載體pCAMBIA1304-OsFAD2,通過農桿菌介導將OsFAD2基因轉入擬

5、南芥fad2突變體中,經潮霉素篩選獲得T3代轉基因種子。RT-PCR結果顯示水稻FAD2基因能夠互補擬南芥fad2突變體表型;同時,將OsFAD2基因導入到秈稻kasalath中,經過潮霉素篩選獲得T2代轉基因種子,我們檢測了低溫條件下的水稻發(fā)芽率、電導率和Fv/Fm,發(fā)現轉基因株系與野生型相比,能夠顯著的耐受低溫脅迫。更為重要的是,過表達OsFAD2基因的水稻株系,在生殖生長期能夠表現出顯著的耐寒性,低溫處理之后,產量比對照組高46％