1、第一部分 地塞米松對腎小球足細胞CD2AP/TRPC6表達和分布的影響
　　 目的：
　　 足細胞的裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）是腎小球選擇性濾過功能中最重要的部分，CD2相關蛋白（CD2-associated protein，CD2AP）、瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（transient receptor potential cation channel 6，TRPC6）、nephrin、podoci

2、n等重要的裂孔隔膜分子共同組成一個信號傳導復合物以維持足突和裂孔隔膜結構和功能的完整性。本研究借助小鼠腎小球足細胞系，觀察嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN)刺激足細胞，及給予地塞米松（dexamethasone，DEX）干預后，足細胞分子CD2AP、TRPC6表達及分布的變化，探討地塞米松對足細胞的保護作用及CD2AP、TRPC6與足細胞損傷修復的相關性。
　　 方法：
　　 1、條件

3、永生型小鼠足細胞系（mouse podocyte clone 5，MPC5）培養(yǎng)：復蘇MPC5細胞，于33℃培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)，平均3～4天細胞增殖至培養(yǎng)瓶底達80％，傳代，置于37℃中培養(yǎng)，約10～14天分化成熟，此時為分化態(tài)的MPC5，可用于實驗。
　　 2、設立對照組、PAN刺激組和DEX干預組。對照組用含0.02％ DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，PAN刺激組在細胞培養(yǎng)液中加入PAN，DEX干預組在細胞培養(yǎng)液中同時

4、加入PAN和DEX，處理后8h，24h和48h觀察細胞形態(tài)并攝相，采用圖像處理軟件分析各組細胞形態(tài)及胞體面積的差別。采用RT-PCR、Western blot和間接免疫熒光染色檢測各時間點CD2AP和TRPC6 mRNA、蛋白表達量及分布變化。
　　 結果：
　　 1、正常情況下，足細胞在33℃含有γ-干擾素的培養(yǎng)液中生長，生長速度較快，細胞排列緊密，小而突起，呈鵝卵石樣，足突樣結構少見；在37℃無γ-干擾素的培養(yǎng)液中生

5、長，生長速度明顯減緩，足細胞呈星形，胞體多透明，大并伸出樹枝樣突起，相鄰細胞間形成相互連接。PAN刺激后足細胞胞體明顯縮?。≒<0.05），出現(xiàn)足突回縮、消失，失去細胞間連接，DEX干預后細胞胞體明顯大于刺激組（P<0.05），大部分足細胞維持正常的足突形態(tài)。
　　 2、正常情況下，CD2AP mRNA和蛋白在足細胞有一定量表達。與對照組比較，PAN損傷細胞后8h，CD2AP mRNA表達明顯下降（P<0.05），一直持續(xù)至刺激

6、后48h。CD2AP蛋白在PAN刺激8h，其表達無明顯變化，在PAN刺激24h和48h后，其蛋白表達顯著下降（P<0.01）。與PAN刺激組相比，DEX干預后8h CD2APmRNA表達無明顯變化，24h及48h時mRNA表達顯著升高（P<0.05），趨向于正常水平。DEX干預8h、24h和48h，CD2AP蛋白表達明顯增多，趨于正常（P<0.01）。
　　 3、正常情況下，TRPC6蛋白在足細胞有一定量表達。與對照組比較，PA

7、N損傷細胞后8h，TRPC6蛋白表達無明顯變化，在PAN刺激24h和48h后TRPC6蛋白表達顯著增高（P<0.01）；地塞米松干預后8h，TRPC6蛋白表達無明顯變化，干預24h后，TRPC6蛋白表達下降，趨于正常（P<0.05），48h后表達顯著下降（P<0.01）。
　　 4、CD2AP在對照組均勻分布于細胞核膜、細胞漿及細胞膜；PAN刺激8h后，呈顆粒狀分布于細胞漿和核周，刺激48h后出現(xiàn)胞膜、胞漿分布缺失；DEX干預后

8、各時間點CD2AP在胞膜、胞漿的分布缺失較PAN刺激組明顯改善，干預48h后，CD2AP在足細胞分布未達完全恢復正常，胞漿尚有少量顆粒樣分布。
　　 5、TRPC6在對照組呈線狀均勻分布于胞膜，在胞質內少量分布；PAN刺激24h后TRPC6主要沿細胞膜呈不連續(xù)性分布，胞質內分布增多；刺激48h后，細胞膜分布增多，部分細胞膜分布缺失，聚集成顆粒狀，胞質內廣泛分布。DEX干預后各時間點TRPC6在細胞膜分布較均勻，在整個細胞的分布較

9、前明顯改善，趨于正常。
　　 結論：
　　 PAN刺激足細胞損傷時，足細胞結構受損，CD2AP、TRPC6表達和分布異常；DEX作用于足細胞后，CD2AP、TRPC6表達和分布趨于穩(wěn)定正常，DEX可能通過維持裂孔隔膜結構和功能的完整，發(fā)揮保護足細胞和抗蛋白尿的作用。
　　 第二部分 激素耐藥型腎病綜合征患兒TRPC6基因變異研究
　　 目的：
　　 腎病綜合征(nephrotic syndrome

10、，NS)是小兒泌尿系統(tǒng)疾病中的常見病。其病因和發(fā)病機制尚不清楚。治療藥物以腎上腺皮質激素為主。約有20％患兒對激素耐藥，反復遷延不愈者最終發(fā)展至終末期腎病。近年研究證實TRPC6突變可導致腎病發(fā)生，臨床主要表現(xiàn)為激素耐藥，大量蛋白尿。激素耐藥性腎病綜合征（steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS）的治療一直是臨床棘手問題。本研究對50例SRNS患兒進行TRPC6基因分析，以探討TRPC6基因與S

11、RNS的臨床特征點和疾病易感性的關系，為我們進行基因診斷、遺傳咨詢及產前診斷，估計疾病預后以及指導臨床治療奠定基礎。
　　 方法：
　　 收集來自廣東地區(qū)漢族50例SRNS患兒和30例正常兒童的病例資料（包括發(fā)病年齡、隨訪時間、發(fā)病至遲發(fā)耐藥時間、遲發(fā)耐藥前復發(fā)次數(shù)和治療方案等臨床數(shù)據(jù)）。采集受試者外周血，采用離心吸附法提取基因組DNA。采用PCR方法分別擴增TRPC6基因外顯子2（exon2）、外顯子12(exon12

12、)、外顯子13 (exon13)及部分內含子，PCR產物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進行直接測序，使用DNAman軟件將所得結果與美國國立生物技術信息中心（NCBI）的基因數(shù)據(jù)庫進行比對；比較兩組受試者的等位基因頻率及基因型頻率，統(tǒng)計其分布差異是否有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.所有受試者均未檢測到TRPC6基因突變；
　　 2.5例SRNS患兒存在單核苷酸多態(tài)性，SNP：135890C＞T，以往未見報道

13、。等位基因頻率（C/T）分別為0.94、0.06；兩組間SNP的基因頻率和基因型差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；
　　 3.檢測出SNP的患兒其發(fā)病年齡明顯晚于未檢出SNP的患兒，且更易早期出現(xiàn)遲發(fā)耐藥（P＜0.05）。5例檢測出SNP的患兒，其中2例為腎組織活檢為FSGS，1例為系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN），其余兩例未做腎組織活檢。
　　 4.SRNS患兒中共有17例患兒接受腎穿刺活檢，10例為FSGS，臨床表

14、現(xiàn)均為反復出現(xiàn)大量蛋白尿，其中2例因治療效果不佳進展為終末期腎病而死亡；
　　 結論：
　　 1.廣東地區(qū)漢族兒童存在由TRPC6基因135890C>T多態(tài)性所致的C、T兩種等位基因，2種組合基因型CC型和CT型；
　　 2.SRNS和正常對照組相比，TRPC6基因SNP在SRNS患兒的基因型和等位基因頻率分布均無顯著性差異，其基因多態(tài)性可能不是本研究中兒童激素耐藥型腎病綜合征發(fā)病的遺傳學基礎；
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