1、背景：
　　自噬（autophagy）是一種自我消化過(guò)程，可將各種待消化物質(zhì)降解成為能夠被重新利用的營(yíng)養(yǎng)成分，從而達(dá)到在清除受損細(xì)胞器或大分子的同時(shí)最大限度地利用自身營(yíng)養(yǎng)成分的目的。自噬是一種普遍存在的生命現(xiàn)象，它在眾多生理及病理?xiàng)l件下均發(fā)揮重要作用。正常條件下，細(xì)胞的自噬維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平，但多種應(yīng)激條件可誘導(dǎo)自噬水平的升高，包括氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)多活性氧（reactive oxygen specie

2、s，ROS）無(wú)法被抗氧化防御體系所清除，造成的應(yīng)激作用。氧化應(yīng)激與自噬的相關(guān)性已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，但具體機(jī)制仍不清楚。在以往氧化應(yīng)激與自噬的研究中，自噬通常伴有大量凋亡或壞死，為一種病理性損傷性自噬，而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)生理性自噬研究甚少。
　　黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是一種將黃嘌呤、次黃嘌呤分解并產(chǎn)生ROS的氧化還原酶，已被作為氧化劑廣泛應(yīng)用于研究中。本研究在篩選氧化劑誘導(dǎo)自噬模型過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)XOD可明顯

3、誘導(dǎo)L-02細(xì)胞自噬，那么該模型與經(jīng)典自噬模型以及已有的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬模型有何優(yōu)勢(shì)？其中機(jī)制如何？對(duì)以上問(wèn)題的系統(tǒng)研究將對(duì)建立優(yōu)效的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬模型，以及針對(duì)自噬的分子機(jī)制和生物學(xué)作用研究提供數(shù)據(jù)和支撐。
　　目的：
　　1．建立一種XOD誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬模型；
　　2．探討XOD誘導(dǎo)自噬模型過(guò)程中線粒體氧化應(yīng)激作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1．體外培養(yǎng)L-02細(xì)胞，采用不同濃度氧化劑（H2O2、

4、GOX、t-BHP、PQ和XOD）、自噬誘導(dǎo)劑（EBSS和Rapamycin）、自噬抑制劑（3-MA）以及多種抗氧化劑（NAC、和MitoQ）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理；
　　2．采用免疫熒光檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ分布狀況,MDC染色檢測(cè)自噬溶酶體數(shù)量及分布；
　　3．Western Blot檢測(cè)標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、p62等蛋白水平以及AKT、ERK、AMPK、p38、mTOR和ULK1等細(xì)胞信號(hào)通路分子的激活狀況；
　　4．透射

5、電子顯微鏡觀察線粒體和細(xì)胞自噬小體的形態(tài)及數(shù)量；
　　5．DCFH-DA和Mito-SOX Red染色流式法分別檢測(cè)細(xì)胞ROS和線粒體ROS水平；
　　6．JC-1染色，共聚焦觀察細(xì)胞膜電位變化；
　　7．Mn-SOD及CAT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD2及CAT活性；
　　8．熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)；
　　9. mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以觀察細(xì)胞自噬通量；
　　10．采

6、用siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)Atg5基因進(jìn)行干擾，降低Atg5蛋白的表達(dá)；
　　11．采用慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以單獨(dú)高表達(dá)細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT以及M-CAT，或共轉(zhuǎn)染同時(shí)高表達(dá)SOD2&CAT以及SOD2&M-CAT；
　　12．Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　1．L-02細(xì)胞活力隨各氧化劑（H2O2、GOX、t-BHP、PQ和XOD）濃度增大而降低，一定濃度H2O2、

7、t-BHP、PQ和XOD處理?xiàng)l件下，自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ水平均有不同程度升高。
　　2．L-02細(xì)胞經(jīng)無(wú)細(xì)胞毒性劑量 XOD處理后，MDC染色結(jié)果顯示，指示酸性自噬泡的藍(lán)色熒光點(diǎn)明顯增多且亮度增強(qiáng)，免疫熒光法標(biāo)記LC3蛋白的熒光點(diǎn)增多， Western Blot檢測(cè)的LC3Ⅱ蛋白水平明顯上調(diào)，TEM結(jié)果顯示細(xì)胞的自噬體形成增加，各指標(biāo)均呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染 L-02細(xì)胞后再給予XOD處理，細(xì)胞自

8、噬通量明顯增加。
　　3．XOD、EBSS以及Rapamycin分別處理L-02細(xì)胞，2h、8h和24h后分別檢測(cè)自噬相關(guān)指標(biāo)MDC染色、IF-LC3染色、LC3Ⅱ蛋白水平，以及細(xì)胞自噬小體數(shù)量的變化，結(jié)果顯示XOD較經(jīng)典自噬誘導(dǎo)劑各指標(biāo)變化均更為明顯。
　　4．通過(guò)劑量篩選，一定劑量的t-BHP、PQ和XOD均可使L-02細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白水平明顯升高，但在引起細(xì)胞自噬的同時(shí)，t-BHP和PQ可引起明顯的細(xì)胞凋亡或壞死，而X

9、OD處理組細(xì)胞存活狀態(tài)無(wú)明顯變化。
　　5．XOD處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)總體ROS及線粒體ROS水平明顯升高。給予NAC或MitoQ處理后，Western Blot結(jié)果顯示自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ水平明顯下降。此外，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)抗氧化酶SOD2和/或CAT/M-CAT，各組ROS水平均有不同程度的降低，其中SOD2&CAT和SOD2&M-CAT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)總ROS以及線粒體 ROS水平均明顯降低，在此基礎(chǔ)上，XOD處理引起的LC

10、3Ⅱ蛋白水平也相應(yīng)明顯降低。
　　6．XOD處理L-02細(xì)胞后，Western Blot結(jié)果顯示ROS相關(guān)信號(hào)通路AKT、p38/MAPK、ERK和AMPK以及自噬相關(guān)蛋白ULK1蛋白磷酸化水平顯著增加。聯(lián)合過(guò)表達(dá)SOD2&CAT和SOD2&M-CAT抗氧化蛋白后可以有效拮抗XOD處理引起的AKT、AMPK及ULK1蛋白磷酸化水平的升高。
　　7．抑制XOD誘導(dǎo)的自噬，細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體ROS水平及細(xì)胞的死亡程度均增加。<

11、br>　　8．XOD處理L-02細(xì)胞后，JC-1結(jié)果顯示線粒體膜電位降低，TEM觀察細(xì)胞內(nèi)有線粒體自噬現(xiàn)象，免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)LC3自噬熒光點(diǎn)與線粒體共定位，即發(fā)生了線粒體自噬，且熒光定量PCR檢測(cè)到線粒體DNA拷貝數(shù)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　我們成功建立了XOD誘導(dǎo)L-02細(xì)胞的自噬模型，與常規(guī)自噬誘導(dǎo)劑相比該模型具有誘導(dǎo)效果明顯、易檢測(cè)及不伴隨凋亡或壞死等優(yōu)點(diǎn)。線粒體ROS在介導(dǎo)了此過(guò)程的發(fā)生，ROS通過(guò)信號(hào)通路AKT和