1、本文論述了應(yīng)用脂肪干細(xì)胞修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。 各種原因造成的關(guān)節(jié)軟骨損傷性疾病在修復(fù)重建外科中很常見。由于軟骨自身結(jié)構(gòu)的特殊性，關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力非常有限，損傷后的關(guān)節(jié)軟骨一般由纖維組織或者纖維軟骨所修復(fù)。目前常用的軟骨或人工代用品移植修復(fù)等方法均存在許多問題,不能修復(fù)重建關(guān)節(jié)軟骨原有的透明軟骨結(jié)構(gòu)。自體軟骨細(xì)胞移植修復(fù)軟骨缺損是效果比較肯定的一種治療方法，但是自體軟骨細(xì)胞移植也存在如細(xì)胞供區(qū)不足、體外培養(yǎng)周期長

2、、供區(qū)易發(fā)生病變和軟骨細(xì)胞表型不易保持等缺點(diǎn)。因此，這一方法的使用受到了限制。組織工程的興起與發(fā)展為軟骨缺損的治療提供了新的思路和方法。 脂肪干細(xì)胞（Adipose-Derived Stem Cells , ADSCs）是間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）中研究較多的種子細(xì)胞之一。有大量的研究表明脂肪干細(xì)胞在體外特定條件下，能夠向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等分化。同時(shí)，Zuk等對(duì)脂

3、肪干細(xì)胞的軟骨分化能力做了比較全面的研究，指出脂肪干細(xì)胞在特定條件下能向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。 但是，應(yīng)用ADSCs作為種子細(xì)胞修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究罕有報(bào)道。ADSCs是否能作為組織工程種子細(xì)胞，并用于修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損，目前尚未明確。因此，探討以自體ADSCs為種子細(xì)胞，PGA/PLA為支架材料，應(yīng)用組織工程方法修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。 此外，應(yīng)用自體ADSCs作為種子細(xì)胞，和其它種子細(xì)胞一樣，仍然會(huì)對(duì)患

4、者機(jī)體造成新的創(chuàng)傷，獲取脂肪組織會(huì)造成患者疼痛不適，更重要的是患者必須等待一段時(shí)間才能得到構(gòu)建組織的治療，不能滿足急性病患者的需要。因此，探討應(yīng)用同種異體成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞一直是組織工程領(lǐng)域的重要研究方向。 前期的研究發(fā)現(xiàn)同種異體ADSCs具有特殊的免疫學(xué)特性，在體外能夠抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。但是，成軟骨誘導(dǎo)后的同種異體ADSCs是否能夠修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損還有待進(jìn)一步的研究。因此，我們探討以同種異體ADSCs為種子細(xì)胞，

5、PGA/PLA為支架材料，應(yīng)用組織工程方法修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，同時(shí)對(duì)其免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探討。 目的： 探討應(yīng)用自體ADSCs和同種異體ADSCs作為種子細(xì)胞、PGA/PLA作為支架材料構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。 方法： 1.豬ADSCs體外多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究：對(duì)豬脂肪組織中分離的基質(zhì)細(xì)胞觀察體外增殖能力，并收集第二代ADSCs分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和成脂

6、肪誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過免疫熒光檢測和RT-PCR檢測，觀察其多向分化潛能。 2.PGA/PLA支架材料與細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)研究：細(xì)胞材料復(fù)合后應(yīng)用Hoechest方法檢測其生長曲線，DiO標(biāo)記細(xì)胞后接種在材料上，觀察細(xì)胞生長情況；掃描電鏡觀察細(xì)胞材料復(fù)合物的粘附情況，細(xì)胞材料復(fù)合物成軟骨誘導(dǎo)后檢測GAG含量。 3.自體ADSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：以自體ADSCs為種子細(xì)胞，以聚羥基乙酸/聚乳酸（Poly

7、glycolic Acid / Polylactic Acid, PGA/PLA）為支架材料，對(duì)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)。以自體ADSCs-PGA/PLA復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)組，以單純的PGA/PLA材料為對(duì)照組，術(shù)后3、6個(gè)月取材，行大體觀察、HE染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色和甲苯胺藍(lán)染色觀察其修復(fù)情況。 4.自體ADSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：以自體ADSCs為種子細(xì)胞，以PGA/PLA為支架材料，對(duì)豬膝

8、關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)。以自體ADSCs-PGA/PLA復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)組，以單純的PGA/PLA材料為對(duì)照組，術(shù)后3、6個(gè)月取材，行大體觀察、HE染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色和甲苯胺藍(lán)染色觀察其修復(fù)情況。 5.同種異體ADSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)及負(fù)重區(qū)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：以成軟骨誘導(dǎo)的同種異體ADSCs為種子細(xì)胞，以PGA/PLA為支架材料，對(duì)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)和負(fù)重區(qū)軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)。以同種異體ADSCs-PGA/PL

9、A復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)組，以單純的PGA/PLA材料為對(duì)照組，術(shù)后3、6個(gè)月取材，行大體觀察、HE染色觀察修復(fù)情況，并檢測細(xì)胞移植后免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)變化。 結(jié)果： 1.豬ADSCs體外多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究：豬ADSCs在體外誘導(dǎo)條件下能夠向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞分化。 2.PGA/PLA支架材料與細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)研究：細(xì)胞生長曲線測定表明細(xì)胞在材料上生長良好；DiO標(biāo)記表明細(xì)胞在材料上呈團(tuán)狀生長，并隨時(shí)間延

10、長而逐漸增加；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PLA在PGA材料中呈網(wǎng)狀或絲狀分布，并把PGA纖維連成一體，能很好的起到塑型作用；細(xì)胞與材料粘附良好，分泌大量的細(xì)胞基質(zhì)包裹PGA/PLA；體外成軟骨誘導(dǎo)的ADSCs-PGA/PLA復(fù)合物有GAG的表達(dá)，并在第2周時(shí)達(dá)最高峰。 3.自體ADSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：術(shù)后3、6個(gè)月分別取材顯示，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)有軟骨樣組織填充。HE染色顯示，術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月，修復(fù)區(qū)有典型

11、透明軟骨結(jié)構(gòu)，但是細(xì)胞密度比正常軟骨組織高；Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示修復(fù)組織表達(dá)軟骨特異Ⅱ型膠原成分；甲苯胺藍(lán)染色顯示修復(fù)組織合成軟骨基質(zhì)GAG。而單純PGA/PLA對(duì)照組則在術(shù)后3、6個(gè)月吸收，缺損區(qū)塌陷，覆蓋有纖維組織。 4.自體ADSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：術(shù)后3、6個(gè)月分別取材顯示，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)有軟骨樣組織填充。HE染色顯示，術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月，修復(fù)區(qū)有典型透明軟骨結(jié)構(gòu)，但是細(xì)胞密度比正常

12、軟骨組織高；Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示修復(fù)組織表達(dá)軟骨特異Ⅱ型膠原成分；甲苯胺藍(lán)染色顯示修復(fù)組織合成軟骨基質(zhì)GAG。而單純PGA/PLA對(duì)照組則在術(shù)后3、6個(gè)月吸收，缺損區(qū)塌陷，覆蓋有纖維組織。 5.同種異體ADSCs修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)及負(fù)重區(qū)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究：術(shù)后3、6個(gè)月分別取材發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組異體ADSCs-PGA/PLA復(fù)合物未能修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨缺損；術(shù)后3個(gè)月取材，實(shí)驗(yàn)組異體ADSCs-PGA/PLA復(fù)合物

13、也未能修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損。而PGA/PLA單層材料對(duì)照組均未被修復(fù)。 結(jié)論： 1.豬ADSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增能力強(qiáng)，具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞分化的多向分化能力。 2.PGA/PLA具有良好的細(xì)胞相容性，成軟骨誘導(dǎo)的豬ADSCs能在其上較好的粘附和生長，并能表達(dá)軟骨基質(zhì)GAG。 3.自體ADSCs-PGA/PLA復(fù)合物能夠修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)的軟骨缺損，而單純PGA/PLA材料則