1、[背景] 肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)內(nèi)在的多藥耐藥性以及化療過程中產(chǎn)牛的獲得性多藥耐藥性是HCC化療失敗的主要原因之一。迄今為止仍沒有發(fā)現(xiàn)用于肝癌化學治療的有效藥物,開發(fā)新的化學治療藥物仍然是中晚期肝癌內(nèi)科治療領域的熱點。蟾酥為我國傳統(tǒng)的抗肝癌中藥材,以蟾酥為主治療肝癌具有非常悠久的歷史。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),蟾酥的有效活性成分——蟾毒靈具有很強的抗肝癌作用,有可能成為克服肝癌多藥耐藥,治療

2、中晚期肝癌的有效藥物。研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈具有抑制耐藥細胞增殖,誘導細胞凋亡的作用,但是其具體機制如何,在體內(nèi)是否具有相同的作用還值得進一步研究。因此,本課題以人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/5-FU為研究對象,在初步證實蟾毒靈能夠抑制肝癌多藥耐藥細胞增殖的基礎上,對其誘導凋亡的作用及機制進行了深入探討,并對其體內(nèi)抑制肝癌的作用進行了初步觀察。 [目的] 研究蟾毒靈誘導人肝癌多藥耐藥BEL-7402/5-FU細胞凋亡的作用,并探

3、討其可能機制。建立人肝癌5-氟尿嘧啶獲得性多藥耐藥裸鼠原位移植瘤模型,評價蟾毒靈對肝癌多藥耐藥模型的抗腫瘤作用。 [方法] 1、蟾毒靈對人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/5-FU增殖的影響 MTT法觀察蟾毒靈、5-氟尿嘧啶、長春新堿、阿霉素、奧沙利鉑、環(huán)磷酰胺對人肝癌BEL-7402/5-FU獲得性多藥耐藥細胞株增殖抑制作用。蟾毒靈對親本及耐藥細胞增殖抑制作用的時效、量效關系。 2、蟾毒靈誘導耐藥細胞

4、株凋亡的作用 光鏡觀察不同濃度(1、0.1、0.01 μM)蟾毒靈作用于人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/5-FU 24 h后細胞形態(tài)學改變。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同濃度蟾毒靈(1、0.1、0.01 μM)作用24 h后細胞凋亡的特征性熒光分布變化。流式細胞術檢測不同濃度蟾毒靈(1、0.1、0.01 μM)作用24 h對人肝癌BEL-7402/5-FU細胞株細胞周期及細胞凋亡的作用。 3、蟾毒靈誘導耐藥細胞凋亡的

5、機制研究 免疫細胞化學和Western blot法檢測蟾毒靈對人肝癌BEL-7402/5-FU細胞Bcl-XL及Bax蛋白表達的影響。流式細胞術檢測蟾毒靈作用后,人肝癌BEL-7402/5-FU細胞株線粒體膜電位的變化與時效關系,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的改變及蟾毒靈對Caspase-9作用的時效-量效關系,并觀察Caspase-9特異性抑制劑對蟾毒靈誘導細胞凋亡的影響。 4、蟾毒靈

6、對裸鼠人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/5-FU原位移植瘤模型的作用 采用“隧道內(nèi)植入法”建立人肝癌5-氟尿嘧啶獲得性多藥耐藥裸鼠原位移植瘤模型。移植12d后,挑選腫瘤大小相近的裸鼠,隨機分為生理鹽水組,氟尿嘧啶組(20 mg/kg·d),蟾毒靈組(1 mg/kg·d)及蟾毒靈(1 mg/kg·d)與5-氟尿嘧啶(20 mg/kg·d)聯(lián)合用藥組(交替給藥),給藥14 d。治療結束后采血行肝腎功能及生化檢查；游標卡尺測量腫瘤

7、最大徑和最小徑,計算腫瘤體積；免疫組化法檢測生理鹽水組TS蛋白表達；HE染色行心、肝、腎組織病理學檢查,同時觀察肝癌組織病理學改變；TUNEL法檢測各組腫瘤組織凋亡率。 [結果] 1、人肝癌BEL-7402/5-FU細胞株對臨床常用化療藥5-氟尿嘧啶、長春新堿、阿霉素、奧沙利鉑、環(huán)磷酰胺的耐藥指數(shù)分別為：18.6±2.85、10.22±2.85、2.12±0.20、5.91±1.08、8.92±2.46,但對蟾毒靈無明顯

8、交叉耐藥性,蟾毒靈對人肝癌BEL-7402/5-FU細胞株的增殖抑制作用呈明顯的濃度依賴性。 2、蟾毒靈處理細胞24 h后可見部分細胞變圓、脫落懸浮于培養(yǎng)液中,細胞體積大小不一,腫脹、固縮的細胞均可見到,細胞內(nèi)顆粒增多、光密度增強。 3、經(jīng)1、0.1、0.01μM蟾毒靈處理人肝癌BEL-7402/5-FU多藥耐藥細胞后, G0/G1期細胞分布比例(％)分別為25.58±3.70、48.09±2.49、55,26±1.97

9、,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。G2/M期比例39.78±1.55、32.14±1.14、19.42±1.04,與對照組相比及組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 4、1、0.1、0.01 μM 蟾毒靈作用于耐藥細胞的凋亡率(％)分別為42.58±2.11、23.27±1.02、18.65±1.36,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)

10、;且凋亡率1μM處理組高于0.1μM組(P<0.01),0.1 μM組高于0.01 μM組(P<0.01)。 5、免疫細胞化學法顯示耐藥細胞可見Bcl-XL、Bax表達。Western blot顯示蟾毒靈組Bcl-XL表達較耐藥細胞減少,Bax表達增加。 6、蟾毒靈作用后,細胞線粒體膜電位降低(P<0.01);隨蟾毒靈作用時間延長,線粒體膜電位逐漸降低,6 h與24 h、12 h與24 h組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0

11、.01)。 7、蟾毒靈作用后Caspase-3、Caspase-9活性增強,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 加入Caspase廣泛阻斷劑后,活性減弱(P<0.01),而Caspase-8活性未見明顯變化(P>0.05)。蟾毒靈作用6、12、24 h后Caspase-9活性均增強,并在24 h內(nèi)呈明顯的時間、濃度依賴性。 8、蟾毒靈處理后,細胞凋亡率為(25.37±3.16)％,高于對照組(P<0.01):

12、Caspase-9特異性抑制劑組細胞凋亡率為(10.5±2.29)％,低于蟾毒靈組(P<0.01),與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 9、蟾毒靈對裸鼠原位移植瘤的影響多藥耐藥裸鼠原位移植瘤模型瘤組織的耐藥蛋白TS呈高水平表達。蟾毒靈組腫瘤體積與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),蟾毒靈聯(lián)合5-氟尿嘧啶組與蟾毒靈組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Tunel法腫瘤組織細胞凋亡率的檢測顯示,5-氟尿

13、嘧啶組細胞凋亡率為(8.7±3.21)％與生理鹽水組(5.4±2.53)％比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),蟾毒靈組為(29.7±4.54)％及聯(lián)合用藥組(45.634±5.50)％均高于生理鹽水組(P<0.01),蟾毒靈組高于5-氟尿嘧啶組(P<0.01),聯(lián)合用藥組高于蟾毒靈組(P<0.01)。肝腎功能、生化指標蟾毒靈組與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),5-氟尿嘧啶組與生理鹽水組比較AST及CL-、K+水平差異有

14、統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 [結論] 1、人肝癌多藥耐藥BEL-7402/5-FU細胞株對蟾毒靈無明顯的交叉耐藥性,蟾毒靈對其具有增殖抑制作用；蟾毒靈對裸鼠原位移植瘤的生長具有顯著的抑制作用,對裸鼠心肝腎等臟器無明顯毒副作用。2、蟾毒靈能誘導人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/5-FU細胞凋亡；3、增加促凋亡蛋白Bax表達、降低抗凋亡蛋白Bcl-XL表達,促進線粒體膜電位耗散繼而活化Caspase-9可能是蟾毒靈誘導