1、妊娠初期，滋養(yǎng)細胞具有獨特的類似腫瘤細胞的生物學(xué)行為，即高增殖、低凋亡和高遷移及侵襲力；同時滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為受到蛻膜微環(huán)境的嚴格調(diào)控，這對囊胚植入、胚胎發(fā)育和正常妊娠的維持起關(guān)鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激參與多種病理性妊娠的發(fā)病，與流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒生長受限(FGR)、早產(chǎn)及死胎等妊娠并發(fā)癥密切關(guān)聯(lián)。過量的活性氧自由基(ROS)可使磷脂中的不飽和脂肪酸生成過氧化脂質(zhì)，損傷生物膜；可以抑制蛋白質(zhì)功能，破壞核酸及染色質(zhì)，從而傷害機

2、體的各種組織和細胞，包括導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞凋亡，降低細胞侵襲力。因此，控制氧化損傷對于成功妊娠和正常妊娠的維持具有重要意義。
　　 環(huán)孢素A(CsA)是具有劃時代意義的免疫抑制劑，其臨床應(yīng)用可顯著改善實體器官移植的近期存活率，是器官移植后免疫抑制和抗排斥反應(yīng)的首選藥物。我們課題組首次發(fā)現(xiàn)，低濃度CsA可顯著提高滋養(yǎng)細胞的增殖與侵襲力，抑制低血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞凋亡，并改善小鼠流產(chǎn)模型的妊娠結(jié)局，提示CsA可能為滋養(yǎng)細胞功能障礙導(dǎo)致的

3、妊娠疾病的潛在治療藥物。與CsA經(jīng)典的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同，我們課題組的研究結(jié)果顯示，CsA可通過活化MAPK/ERK通路提高滋養(yǎng)細胞的增殖及侵襲力。
　　 本研究在前期工作基礎(chǔ)上，進一步研究在細胞生物學(xué)功能調(diào)控中起重要作用的粘著斑激酶(FAK)信號通路是否參與CsA調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的遷移與侵襲；并通過用H2O2處理人絨毛膜上皮癌細胞系JEG-3細胞，建立滋養(yǎng)細胞氧化損傷的體外模型，在氧化應(yīng)激條件下進一步解析CsA減輕滋養(yǎng)細胞損傷

4、的分子機制，以及相應(yīng)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為拓展CsA的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 第一部分環(huán)孢素A通過FAK信號通路促進滋養(yǎng)細胞遷移與侵襲
　　 目的：探討FAK信號通路是否參與介導(dǎo)CsA促進滋養(yǎng)細胞遷移與侵襲，以及FAK信號通路與ERK信號通路間的相互作用。
　　 方法：用CsA(1μM)處理滋養(yǎng)細胞，或用FAK抑制劑Y15、Src抑制劑PP2、MEK抑制劑U0126分別預(yù)處理滋養(yǎng)細胞后再用CsA處理，采用

5、Transwell遷移試驗和Matrigel侵襲試驗分析滋養(yǎng)細胞的遷移及侵襲力，Western blot分析滋養(yǎng)細胞FAK、Src及ERK的磷酸化水平及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和金屬基質(zhì)蛋白酶MMP2、MMP9的表達水平，明膠酶譜實驗分析滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清MMP2、MMP9的活性。
　　 結(jié)果：CsA可顯著提高原代滋養(yǎng)細胞及JEG-3細胞FAK及其接頭分子Src的磷酸化水平。Y15和PP2均能阻斷CsA升調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的

6、遷移及侵襲。Y15和PP2可抑制CsA增高的FAK、Src及ERK的磷酸化水平，U0126可抑制CsA增高的ERK磷酸化水平，但對FAK及Src的磷酸化水平無顯著影響。Y15、PP2和U0126均可消除CsA對E-cadherin表達的下調(diào)作用和對MMP2、MMP9表達及活性的上調(diào)作用。
　　 結(jié)論：CsA通過FAK-Src信號通路促進ERK信號通路活化，下調(diào)E-cadherin表達，上調(diào)MMP2、MMP9的表達及分泌，進而促進

7、滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲。
　　 第二部分氧化應(yīng)激損傷滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為
　　 目的：分析H2O2對JEG-3細胞生物學(xué)行為的影響，建立滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激損傷模型。
　　 方法：用不同濃度的H2O2處理JEG-3細胞24 h，采用MTT法分析滋養(yǎng)細胞活力，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平，JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位，Annexin V/PI雙標記檢測細胞早期凋亡，M

8、atrigel侵襲試驗檢測細胞的侵襲力，以建立滋養(yǎng)細胞氧化損傷模型。
　　 結(jié)果：500μM H2O2處理JEG-3細胞24 h后，細胞活力顯著下降，形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞皺縮，間隙增大，體積減小，細胞核縮小，染色質(zhì)凝集，呈顆粒團塊狀分布；細胞ROS產(chǎn)生增加，線粒體膜電位下降，凋亡比例升高，細胞侵襲力顯著下降。更高濃度的H2O2(從750μM開始)則誘發(fā)細胞大量脫落壞死，侵襲力喪失。
　　 結(jié)論：JEG-3細胞經(jīng)500μ

9、M H2O2處理24 h呈現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損傷，用此條件建立氧化應(yīng)激模型，為研究滋養(yǎng)細胞氧化損傷及抗氧化應(yīng)激藥物的作用機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分環(huán)孢素A緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞損傷
　　 目的：解析CsA對H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞生物學(xué)行為損傷的保護作用及其分子機制。
　　 方法：用低濃度CsA(1μM)預(yù)處理JEG-3細胞24h，再經(jīng)H2O2(500μM)刺激誘導(dǎo)氧化損傷，采用MTT比色法分析滋養(yǎng)細胞活力，

10、倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，Annexin V/PI雙標記檢測細胞早期凋亡，Matrigel侵襲試驗檢測細胞的侵襲力，DHE熒光探針檢測細胞ROS水平，化學(xué)比色法檢測細胞丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性，JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果：與H2O2單獨處理組比較，JEG-3細胞經(jīng)低濃度CsA干預(yù)后，細胞活

11、力明顯升高，形態(tài)得以改善；細胞凋亡比例下降，侵襲力增加；細胞內(nèi)ROS、MDA含量明顯下降，SOD、CAT的活性顯著升高：線粒體膜電位水平恢復(fù)；p53的表達和磷酸化水平下降，Bax表達減少，Bcl-2表達增加，caspase-3前體增多，裂解的PARP大片段減少。
　　 結(jié)論：CsA干預(yù)可明顯改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下JEG-3細胞的生物學(xué)行為；減輕細胞氧化損傷程度，增強細胞的抗氧化損傷能力；抑制線粒體相關(guān)的凋亡信號通路及caspase-

12、3活化，減少滋養(yǎng)細胞凋亡。
　　 第四部分環(huán)孢素A通過調(diào)節(jié)FAK-Sre和MAPK信號通路緩解滋養(yǎng)細胞氧化損傷
　　 目的：解析CsA緩解滋養(yǎng)細胞氧化損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法：用低濃度CsA(1μM)處理JEG-3細胞24h，再經(jīng)H2O2(500μM)刺激誘導(dǎo)氧化損傷，采用Western blot分析CsA對氧化應(yīng)激的滋養(yǎng)細胞FAK、Src及MAPKs磷酸化水平的影響；在此基礎(chǔ)上，用FAK抑制劑Y15、S

13、rc抑制劑PP2分別預(yù)處理處理JEG-3細胞，MTT法測定細胞活力，DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平，JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位，Annexin V/PI雙標記檢測細胞早期凋亡，Matrigel侵襲實驗檢測細胞的侵襲力；用MAPKs信號通路抑制劑(SB203580、SP600125、U0126)分別預(yù)處理JEG-3細胞，MTT法分析細胞活力。
　　 結(jié)果：H2O2刺激可引起JEG-3細胞FAK、Src磷酸化水平下降，

14、p38 MAPK、JNK和ERK的磷酸化水平升高。CsA預(yù)處理JEG-3細胞后再經(jīng)H2O2刺激，F(xiàn)AK、Src磷酸化水平明顯升高，p38 MAPK、JNK磷酸化水平明顯下降，ERK磷酸化水平無顯著性變化。Y15和PP2處理細胞后，再經(jīng)CsA和H2O2聯(lián)合處理，與CsA和H2O2聯(lián)合處理組比較，滋養(yǎng)細胞活力下降，ROS產(chǎn)生增加，線粒體膜電位下降，凋亡比例升高，侵襲力下降。p38 MAPK抑制劑SB203580或JNK抑制劑SP600125

15、處理細胞后，再經(jīng)H2O2處理，滋養(yǎng)細胞活力較H2O2處理組升高；而MEK抑制劑U0126處理后，細胞活力進一步下降。
　　 結(jié)論：低濃度CsA通過促進FAK-Src信號通路活化，抑制p38 MAPK和JNK信號通路活化，發(fā)揮對氧化損傷的滋養(yǎng)細胞的保護作用。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度CsA對人滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為具有多重調(diào)節(jié)作用：(1)通過FAK-Src信號通路促進ERK信號通路活化，下調(diào)E-cadherin表達，

16、上調(diào)MMP2、MMP9的表達及分泌，促進正常滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲；(2)通過降調(diào)節(jié)ROS及MDA的生成，升調(diào)節(jié)SOD和CAT的活性，緩解滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激損傷；(3)通過抑制線粒體相關(guān)的凋亡通路，降低caspase-3活化水平，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞凋亡；(4)通過促進FAK-Src信號通路活化，抑制p38 MAPK和JNK信號通路活化，發(fā)揮對氧化損傷的滋養(yǎng)細胞的保護作用。這些研究結(jié)果顯示，CsA的藥理作用及其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路遠超過