1、華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)為鞘翅目鰓金龜科昆蟲,是國內(nèi)外公認的難防治的土棲性害蟲。圍食膜(peritrophic membrane,PM)是昆蟲體內(nèi)保護其中腸的第一道天然屏障,在昆蟲中腸的消化過程及保護昆蟲免受微生物和寄生蟲侵害等方面發(fā)揮著重要作用。昆蟲中腸圍食膜蛋白的分離鑒定能夠為深入研究害蟲的生防機制,尋找生物防治新靶標,以及進一步明確圍食膜與病原微生物之間相互作用的分子機理等提供前提和基礎(chǔ)。本研究在構(gòu)建

2、華北大黑鰓金龜中腸cDNA表達文庫的基礎(chǔ)上,對其進行免疫篩選,并對篩選得到的圍食膜靶標蛋白進行了分離與鑒定,所得的主要結(jié)果如下:
　　 1.提取華北大黑鰓金龜幼蟲中腸總RNA,分離得到mRNA,利用Uni-ZAP XR載體,成功構(gòu)建高質(zhì)量的華北大黑鰓金龜幼蟲中腸cDNA表達文庫。經(jīng)鑒定,該cDNA文庫滴度為5.18×106pfu／mL,重組率為98.8％,擴增后文庫滴度為2.36×109pfu／mL,插入cDNA片段的長度平均為

3、1.85kb。其后,以棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)圍食膜蛋白血清為抗體,對該文庫進行免疫篩選。經(jīng)過篩選,共得到陽性克隆254個。其中包括4個全長基因HoCBP2、HoCBP76、HoSCP、HoChi,以及1個基因片段HoIIM。
　　 2.HoCBP2基因及HoCBP76基因,編碼華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。其中HoCBP2基因全長2226bp,GenBank登錄號為JF681185,開放閱讀

4、框長1947bp,編碼649個氨基酸。HoCBP2蛋白N-端具有19個氨基酸的前導信號序列,預期蛋白分子量70.2kDa,等電點3.52。Blast比對結(jié)果顯示,其序列與鞘翅目昆蟲赤擬谷盜(Tribolium castaneum)圍食膜蛋白PMP14(GenBank登錄號GU128106)相似性最高,為35％。結(jié)構(gòu)域分析表明HoCBP2蛋白包含8個具有peritrophin-A結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)蛋白結(jié)合功能域(CBD,chitin bin

5、ding domain)。HoCBP76基因全長2019bp,GenBank登錄號為JF681186,開放閱讀框長1725 bp,編碼575個氨基酸。HoCBP76蛋白N-端具有19個氨基酸的前導信號序列,預期蛋白分子量62.3kDa。等電點3.51。Blast比對結(jié)果表明,其序列與Tribolium castaneum圍食膜蛋白PMP14相似性最高,為34％。結(jié)構(gòu)域分析表明HoCBP76蛋白包含7個CBD。成功構(gòu)建原核表達載體pET2

6、1b-HoCBP2和pET21b-HoCBP76,分別表達了約120 kDa及110 kDa的目的蛋白。
　　 利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組表達載體Bac-HoCBP2及Bac-HoCBP76,轉(zhuǎn)染BTI-Tn-5B1-4細胞,實現(xiàn)了其在昆蟲細胞中的成功表達。Westernblot檢測表明,重組后的HoCBP2和HoCBP76蛋白表達的蛋白分子量約為120kDa和110kDa。幾丁質(zhì)結(jié)合活性試驗結(jié)果

7、表明,HoCBP2和HoCBP76重組蛋白均具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性,重組蛋白經(jīng)PBS及1M NaCl處理后,不能從幾丁質(zhì)／蛋白復合物中解離,而用強變性劑6M尿素及1％Calcoflour處理后,重組蛋白從幾丁質(zhì)／蛋白復合物中大量釋放。成功分離得到HoCBP2及HoCBP76的特異抗體,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HoCBP2和HoCBP76在華北大黑鰓金龜幼蟲中腸前、中,后部均勻分布,圍食膜、中腸、糞便及卵中均存在CBP蛋白,而在其體壁

8、、消化液、脂肪體、蛻及馬氏管中未見陽性信號。
　　 3.HoChi基因,編碼華北大黑鰓金龜幼蟲幾丁質(zhì)酶,該基因全長1636bp,GenBank登錄號為HM596340,開放閱讀框長1458bp,編碼486個氨基酸,預期蛋白分子量為51.8kDa,等電點為5.58。其5’端和3’端各有一個長27bp和145bp的非翻譯區(qū),在polyA末端上游39bp處有一個多聚腺甘酸終止信號序列AAGAAA。該蛋白具有典型的幾丁質(zhì)酶特性,即一個信

9、號肽、一個幾丁質(zhì)酶活性位點、一個C端蘇氨酸富集區(qū)和一個幾丁質(zhì)結(jié)合域,屬于幾丁質(zhì)酶18家族。其氨基酸序列與赤擬谷盜幾丁質(zhì)酶蛋白(GenBank登錄號NM001044629)具有較高的相似性。將該基因與pET28b載體重組后,經(jīng)IPTG誘導,Western blot鑒定,該蛋白在大腸桿菌中得到表達。利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功構(gòu)建重組表達載體pFastBac-HoChi,轉(zhuǎn)染BTI-Tn-5B1-4細胞后,實現(xiàn)了其在昆蟲

10、細胞中的成功表達。
　　 4.HoSCP基因,編碼華北大黑鰓金龜幼蟲絲氨酸羧肽酶,GenBank登錄號為JF681184。該基因全長1830bp,開放閱讀框長1371 bp,編碼457個氨基酸。推導的蛋白質(zhì)分子量為51.2kDa,等電點為6.12。其5’端具有78bp的非翻譯區(qū)及起始密碼子ATG,3’端具有381bp的非翻譯區(qū),并且含有終止密碼子TAA,在polyA末端上游14bp處有一個多聚腺甘酸終止信號序列AATAAA。N-

11、末端具有15個氨基酸的前導信號序列,表明其是分泌型蛋白。序列分析表明,HoSCP含有一個保守的S10肽酶結(jié)構(gòu)域、一個絲氨酸活性位點序列IAGESYAG、一個組氨酸活性位點序列FAFLkVYGAGHMVPMDQP以及兩個N-聯(lián)糖基化位點,并且含有絲氨酸羧肽酶保守催化三聯(lián)體位點Ser-185,Asp-361,His-418。將該基因與pET28b載體重組后,經(jīng)IPTG誘導,Western blot鑒定,該蛋白在大腸桿菌中得到表達。利用Bac

12、-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功構(gòu)建重組表達載體pFastBac-HoSCP,轉(zhuǎn)染BTI-Tn-5B1-4細胞后,實現(xiàn)了其在昆蟲細胞中的成功表達。
　　 5.HoIIM基因,編碼華北大黑鰓金龜腸幼蟲圍食膜粘蛋白,長1879bp,最長讀碼框長1707bp,編碼569個氨基酸,GenBank登錄號為JF681187。結(jié)構(gòu)域分析表明,HoIIM蛋白5個具有peritrophin-A結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域、5個粘蛋白結(jié)構(gòu)域。其

13、粘蛋白結(jié)構(gòu)域富含蘇氨酸(Thr,T)、脯氨酸(Pro,P)和絲氨酸(Ser,S),分別占29.3％、15.5％及3.91％,并含有大量重復序列,其中PTTTPTT共重復15次,PTSTTTPTTITT及STTTT分別重復5次,TTPTTP重復4次。對華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜蛋白組分的銀染分析表明,其圍食膜蛋白種類較多。其中分子量大小大約為160kDa和80kDa的兩條蛋白條帶,與經(jīng)PAS方法檢測到的呈明顯紅色的兩種糖蛋白大小相符。從粉紋