1、華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)為鞘翅目鰓金龜科昆蟲,是國內(nèi)外公認(rèn)的難防治的土棲性害蟲。圍食膜(peritrophic membrane,PM)是昆蟲體內(nèi)保護(hù)其中腸的第一道天然屏障,在昆蟲中腸的消化過程及保護(hù)昆蟲免受微生物和寄生蟲侵害等方面發(fā)揮著重要作用。昆蟲中腸圍食膜蛋白的分離鑒定能夠?yàn)樯钊胙芯亢οx的生防機(jī)制,尋找生物防治新靶標(biāo),以及進(jìn)一步明確圍食膜與病原微生物之間相互作用的分子機(jī)理等提供前提和基礎(chǔ)。本研究在構(gòu)建

2、華北大黑鰓金龜中腸cDNA表達(dá)文庫的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行免疫篩選,并對(duì)篩選得到的圍食膜靶標(biāo)蛋白進(jìn)行了分離與鑒定,所得的主要結(jié)果如下:
　　 1.提取華北大黑鰓金龜幼蟲中腸總RNA,分離得到mRNA,利用Uni-ZAP XR載體,成功構(gòu)建高質(zhì)量的華北大黑鰓金龜幼蟲中腸cDNA表達(dá)文庫。經(jīng)鑒定,該cDNA文庫滴度為5.18×106pfu／mL,重組率為98.8％,擴(kuò)增后文庫滴度為2.36×109pfu／mL,插入cDNA片段的長(zhǎng)度平均為

3、1.85kb。其后,以棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)圍食膜蛋白血清為抗體,對(duì)該文庫進(jìn)行免疫篩選。經(jīng)過篩選,共得到陽性克隆254個(gè)。其中包括4個(gè)全長(zhǎng)基因HoCBP2、HoCBP76、HoSCP、HoChi,以及1個(gè)基因片段HoIIM。
　　 2.HoCBP2基因及HoCBP76基因,編碼華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。其中HoCBP2基因全長(zhǎng)2226bp,GenBank登錄號(hào)為JF681185,開放閱讀

4、框長(zhǎng)1947bp,編碼649個(gè)氨基酸。HoCBP2蛋白N-端具有19個(gè)氨基酸的前導(dǎo)信號(hào)序列,預(yù)期蛋白分子量70.2kDa,等電點(diǎn)3.52。Blast比對(duì)結(jié)果顯示,其序列與鞘翅目昆蟲赤擬谷盜(Tribolium castaneum)圍食膜蛋白PMP14(GenBank登錄號(hào)GU128106)相似性最高,為35％。結(jié)構(gòu)域分析表明HoCBP2蛋白包含8個(gè)具有peritrophin-A結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)蛋白結(jié)合功能域(CBD,chitin bin

5、ding domain)。HoCBP76基因全長(zhǎng)2019bp,GenBank登錄號(hào)為JF681186,開放閱讀框長(zhǎng)1725 bp,編碼575個(gè)氨基酸。HoCBP76蛋白N-端具有19個(gè)氨基酸的前導(dǎo)信號(hào)序列,預(yù)期蛋白分子量62.3kDa。等電點(diǎn)3.51。Blast比對(duì)結(jié)果表明,其序列與Tribolium castaneum圍食膜蛋白PMP14相似性最高,為34％。結(jié)構(gòu)域分析表明HoCBP76蛋白包含7個(gè)CBD。成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET2

6、1b-HoCBP2和pET21b-HoCBP76,分別表達(dá)了約120 kDa及110 kDa的目的蛋白。
　　 利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體Bac-HoCBP2及Bac-HoCBP76,轉(zhuǎn)染BTI-Tn-5B1-4細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)了其在昆蟲細(xì)胞中的成功表達(dá)。Westernblot檢測(cè)表明,重組后的HoCBP2和HoCBP76蛋白表達(dá)的蛋白分子量約為120kDa和110kDa。幾丁質(zhì)結(jié)合活性試驗(yàn)結(jié)果

7、表明,HoCBP2和HoCBP76重組蛋白均具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性,重組蛋白經(jīng)PBS及1M NaCl處理后,不能從幾丁質(zhì)／蛋白復(fù)合物中解離,而用強(qiáng)變性劑6M尿素及1％Calcoflour處理后,重組蛋白從幾丁質(zhì)／蛋白復(fù)合物中大量釋放。成功分離得到HoCBP2及HoCBP76的特異抗體,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HoCBP2和HoCBP76在華北大黑鰓金龜幼蟲中腸前、中,后部均勻分布,圍食膜、中腸、糞便及卵中均存在CBP蛋白,而在其體壁

8、、消化液、脂肪體、蛻及馬氏管中未見陽性信號(hào)。
　　 3.HoChi基因,編碼華北大黑鰓金龜幼蟲幾丁質(zhì)酶,該基因全長(zhǎng)1636bp,GenBank登錄號(hào)為HM596340,開放閱讀框長(zhǎng)1458bp,編碼486個(gè)氨基酸,預(yù)期蛋白分子量為51.8kDa,等電點(diǎn)為5.58。其5’端和3’端各有一個(gè)長(zhǎng)27bp和145bp的非翻譯區(qū),在polyA末端上游39bp處有一個(gè)多聚腺甘酸終止信號(hào)序列AAGAAA。該蛋白具有典型的幾丁質(zhì)酶特性,即一個(gè)信

9、號(hào)肽、一個(gè)幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)、一個(gè)C端蘇氨酸富集區(qū)和一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域,屬于幾丁質(zhì)酶18家族。其氨基酸序列與赤擬谷盜幾丁質(zhì)酶蛋白(GenBank登錄號(hào)NM001044629)具有較高的相似性。將該基因與pET28b載體重組后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Western blot鑒定,該蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)。利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pFastBac-HoChi,轉(zhuǎn)染BTI-Tn-5B1-4細(xì)胞后,實(shí)現(xiàn)了其在昆蟲

10、細(xì)胞中的成功表達(dá)。
　　 4.HoSCP基因,編碼華北大黑鰓金龜幼蟲絲氨酸羧肽酶,GenBank登錄號(hào)為JF681184。該基因全長(zhǎng)1830bp,開放閱讀框長(zhǎng)1371 bp,編碼457個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為51.2kDa,等電點(diǎn)為6.12。其5’端具有78bp的非翻譯區(qū)及起始密碼子ATG,3’端具有381bp的非翻譯區(qū),并且含有終止密碼子TAA,在polyA末端上游14bp處有一個(gè)多聚腺甘酸終止信號(hào)序列AATAAA。N-

11、末端具有15個(gè)氨基酸的前導(dǎo)信號(hào)序列,表明其是分泌型蛋白。序列分析表明,HoSCP含有一個(gè)保守的S10肽酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)絲氨酸活性位點(diǎn)序列IAGESYAG、一個(gè)組氨酸活性位點(diǎn)序列FAFLkVYGAGHMVPMDQP以及兩個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn),并且含有絲氨酸羧肽酶保守催化三聯(lián)體位點(diǎn)Ser-185,Asp-361,His-418。將該基因與pET28b載體重組后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Western blot鑒定,該蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)。利用Bac

12、-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pFastBac-HoSCP,轉(zhuǎn)染BTI-Tn-5B1-4細(xì)胞后,實(shí)現(xiàn)了其在昆蟲細(xì)胞中的成功表達(dá)。
　　 5.HoIIM基因,編碼華北大黑鰓金龜腸幼蟲圍食膜粘蛋白,長(zhǎng)1879bp,最長(zhǎng)讀碼框長(zhǎng)1707bp,編碼569個(gè)氨基酸,GenBank登錄號(hào)為JF681187。結(jié)構(gòu)域分析表明,HoIIM蛋白5個(gè)具有peritrophin-A結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域、5個(gè)粘蛋白結(jié)構(gòu)域。其

13、粘蛋白結(jié)構(gòu)域富含蘇氨酸(Thr,T)、脯氨酸(Pro,P)和絲氨酸(Ser,S),分別占29.3％、15.5％及3.91％,并含有大量重復(fù)序列,其中PTTTPTT共重復(fù)15次,PTSTTTPTTITT及STTTT分別重復(fù)5次,TTPTTP重復(fù)4次。對(duì)華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜蛋白組分的銀染分析表明,其圍食膜蛋白種類較多。其中分子量大小大約為160kDa和80kDa的兩條蛋白條帶,與經(jīng)PAS方法檢測(cè)到的呈明顯紅色的兩種糖蛋白大小相符。從粉紋